Tiobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Tahlil kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi

Lipid peroksidasyonu, reaktif oksijen türleri ve reaktif azot türleri gibi serbest radikallerin lipitlerdeki karbon-karbon çift bağlarına saldırdığı, bir hidrojenin karbondan soyutlanması ve bir oksijen molekülünün yerleştirilmesini içeren bir süreçtir. Bu işlem, birincil ürünler olarak lipid peroksil radikalleri ve hidroperoksitlerin yanı sıra malondialdehit (MDA) ve baskın ikincil ürünler olarak 4-hidroksinononal dahil olmak üzere karmaşık ürünlerin bir karışımına yol ^açar1.

MDA, tiaobarbitürik asit (TBA) ile olan facile reaksiyonu nedeniyle lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Reaksiyon, ₅₃₂ nm’de görünür spektrumda emilen ve kırmızı-pembe ^{bir renk2} üreten bir konjuge olan MDA-TBA2 oluşumuna yol açar. MDA’nın yanı sıra lipid peroksidasyonundan elde edilen diğer moleküller de TBA ile reaksiyona alabilir ve 532 nm’de ışığı emerek ölçülen genel emilim sinyaline katkıda bulunabilir. Benzer şekilde, MDA diğer ana biyomolekül sınıflarının çoğuyla reaksiyona girerek ^TBA3,4 ile reaksiyona erişilebilirliğini potansiyel olarak sınırlayabilir. Bu nedenle, bu geleneksel test sadece “tiyobakroturik asit reaktif maddeleri” veya TBARS5’i ölçmek için kabul edilir.

Doğru uygulandığında ve yorumlandığında, TBARS tahlili genellikle biyolojik bir örnekteki genel oksidatif stres seviyelerinin iyi bir göstergesi olarak kabul ^edilir6. Ne yazık ki, Khoubnasabjafari ve diğerleri tarafından belgelenen TBARS tahlilleri genellikle şüpheli sonuçları kolaylaştıracak şekilde yürütülür ve yorumlanır3,4,7,8,9,10,11. Bunun nedenleri öncelikle örnekle ilgili ön analitik değişkenlere ve tahlil sonuçlarında önemli değişiklikler olmadan test protokolünde görünüşte küçük varyasyonları yasaklayan test sağlamlığı eksikliğine dayanır1,7,12,13.

Biyospepsimen elleçleme ve depolama ile ilgili preanalitik değişkenler (örneğin, geçici olarak -20 °C’de tutulan kan plazması)^14,15 TBARS tahlil sonuçları üzerinde büyük bir etkiye sahip ^{olabilir16,17}; öyle ki, TBARS test sonuçları, açık detaylandırıcı analitik doğrulama verileri tarafından garanti edilmediği sürece farklı laboratuvarlarda karşılaştırılmamalıdır. Bu öneri, batı lekelerinin yaygın olarak nasıl kullanıldığına ve yorumlandırıldığına benzer. Bant yoğunluklarının karşılaştırılması leke içi ve belki de laboratuvar içi çalışmalar için geçerlidir, ancak laboratuvarlar arasındaki bant yoğunluklarının karşılaştırılması genellikle geçersiz bir uygulama olarak kabul edilir.

Bazı araştırmacılar, TBARS testi tarafından ölçülen MDA’nın kabul edilebilir bir biyobelirteç3,9,10,18,19’un gerektirdiği analitik veya klinik kriterleri karşılamadığını öne sürmektedir^. Nitekim, tahlil 50 yıl önce geliştirilmeseydi, muhtemelen bugünkü yaygın kullanım ve zımni kabul edilebilirliği kazanamayacaktı. Oksidatif stresin belirlenmesinde kullanılan daha fazla analitik hassasiyet, özgüllük ve sağlamlığa sahip başka tahliller olmasına rağmen, 532 nm’deki absorbansa dayanan TBARS tahlilleri, lipid peroksidasyon20’nin belirlenmesi ve böylece oksidatif stresin değerlendirilmesi için açık ara en sık kullanılan tahlillerden biri olarak kalmaktadır.

TBARS tahlilleri sadece, talimatların kullanılan reaktiflerin çoğu konsantrasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlamadığı pahalı bir kit (400 ABD dolarının üzerinde) olarak bulunabilir. Ayrıca, sağlanan reaktifler yalnızca bir deneme için kullanılabilir, çünkü kit başına yalnızca bir kolorimetrik standart eğri yapılabilir. Bu, farklı zaman noktalarında birkaç örnek içinde oksidasyon seviyelerini belirlemeyi amaçlayan araştırmacılar için sorunlu olabilir, çünkü aynı standart eğri birden çok kez kullanılamaz. Bu nedenle, birden fazla deney için birden fazla kit satın alınması gerekir. Şu anda, pahalı bir kit satın alınmadığı sürece, TBARS testini nasıl gerçekleştireceklerine dair ayrıntılı bir protokol yoktur. Geçmişte bazı araştırmacılar bir TBARS tahlilinin nasıl gerçekleştirildiğini belirsiz bir şekilde ^{tanımlamıştır21,22}, ancak TBARS tahlilinin pahalı bir kit olmadan nasıl yürütüleceklerine dair tam ayrıntılı bir protokol veya kapsamlı bir video literatürde mevcut değildir.

Burada, TBARS testlerinin basit, tekrarlanabilir ve ucuz bir şekilde nasıl gerçekleştirilacağı hakkında ayrıntılı, analitik olarak doğrulanmış bir amaç için metodoloji rapor ediyoruz. Cu(II) iyonları ile tedavi üzerine insan serumu, HepG2 lisates ve düşük yoğunluklu lipoproteinlerin lipid peroksidasyonundaki değişiklikler TBARS testi için açıklayıcı uygulamalar olarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bu TBARS tahlilinin günlük olarak tutarlı ve tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.