Evaluatie van oxidatieve stress in biologische monsters met behulp van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test

Lipideperoxidatie is een proces waarbij vrije radicalen, zoals reactieve zuurstofsoorten en reactieve stikstofsoorten, koolstof-koolstof dubbele bindingen in lipiden aanvallen, een proces waarbij een waterstof uit een koolstof wordt gewonnen en een zuurstofmolecuul wordt ingebracht. Dit proces leidt tot een mengsel van complexe producten, waaronder lipide peroxylradicalen en hydroperoxiden als primaire producten, evenals malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenaal als overheersende secundaire ^producten1.

MDA is veel gebruikt in biomedisch onderzoek als een marker van lipideperoxidatie vanwege de gemakkelijke reactie met thiobarbiturinezuur (TBA). De reactie leidt tot de vorming van MDA-TBA2, een conjugaat dat absorbeert in het zichtbare spectrum bij 532 nm en een rood-roze kleur ^produceert2. Andere moleculen afgeleid van lipideperoxidatie naast MDA kunnen ook reageren met TBA en licht absorberen bij 532 nm, wat bijdraagt aan het totale absorptiesignaal dat wordt gemeten. Evenzo kan MDA reageren met de meeste andere belangrijke klassen van biomoleculen, waardoor de toegankelijkheid voor reactie met ^TBA3,4 mogelijk wordt beperkt. Als zodanig wordt deze traditionele test eenvoudigweg beschouwd als het meten van “thiobarbiturinezuur reactieve stoffen” of ^TBARS5.

Wanneer de TBARS-test correct wordt toegepast en geïnterpreteerd, wordt deze over het algemeen beschouwd als een goede indicator van de totale niveaus van oxidatieve stress in een biologisch ^monster6. Helaas, zoals gedocumenteerd door Khoubnasabjafari en anderen, wordt de TBARS-test vaak uitgevoerd en geïnterpreteerd op manieren die dubieuze conclusies mogelijk maken3,4,7,8,9,10,11. De oorzaken hiervoor zijn voornamelijk geworteld in steekproefgerelateerde pre-analytische variabelen en een gebrek aan assay-robuustheid die schijnbaar kleine variaties in het assayprotocol verbiedt zonder substantiële veranderingen in assayresultaten1,7,12,13.

Preanalytische variabelen met betrekking tot de hantering en opslag van biospecimenen (bv. bloedplasma dat tijdelijk op -20 °C wordt gehouden)^14,15 kunnen een grote invloed hebben op de resultaten van de TBARS-test16,17; zozeer zelfs dat de resultaten van TBARS-assays niet tussen verschillende laboratoria mogen worden vergeleken, tenzij dit wordt gerechtvaardigd door expliciete interlaboratoriumanalyseve validatiegegevens. Deze aanbeveling is vergelijkbaar met hoe western blots vaak worden gebruikt en geïnterpreteerd. Vergelijkingen van banddichtheden zijn geldig voor binnen-blot en misschien binnen-laboratoriumstudies, maar het vergelijken van banddichtheden tussen laboratoria wordt over het algemeen als een ongeldige praktijk beschouwd.

Sommige onderzoekers hebben gesuggereerd dat MDA zoals gemeten door de TBARS-test eenvoudigweg niet voldoet aan de analytische of klinische criteria die vereist zijn voor een aanvaardbare biomarker3,9,10,18,19. Inderdaad, als de test niet meer dan 50 jaar geleden was ontwikkeld, zou het waarschijnlijk niet het wijdverspreide gebruik en de stilzwijgende aanvaardbaarheid hebben gekregen die het vandaag heeft. Hoewel er andere assays zijn met een grotere analytische gevoeligheid, specificiteit en robuustheid die worden gebruikt voor het bepalen van oxidatieve stress, blijft de TBARS-assay op basis van absorptie bij 532 nm veruit een van de meest gebruikte assays voor de bepaling van lipideperoxidatie20, en daarmee beoordeling van oxidatieve stress.

De TBARS-test is alleen te vinden als een dure kit (meer dan 400 Amerikaanse dollars), waarin de instructies geen gedetailleerde informatie geven over de meeste concentraties van de gebruikte reagentia. Bovendien kunnen de meegeleverde reagentia slechts voor één experiment worden gebruikt, omdat er slechts één colorimetrische standaardcurve per kit kan worden gemaakt. Dit kan problematisch zijn voor onderzoekers die van plan zijn om niveaus van oxidatie te bepalen binnen een paar monsters op verschillende tijdstippen, omdat dezelfde standaardcurve niet op meerdere tijdstippen kan worden gebruikt. Daarom moeten meerdere kits worden gekocht voor meerdere experimenten. Momenteel is er, tenzij een dure kit wordt gekocht, geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor het uitvoeren van een TBARS-test. Sommige onderzoekers hebben in het verleden vaag beschreven hoe een TBARS-assay21,22 moet worden uitgevoerd, maar noch een volledig gedetailleerd protocol of uitgebreide video over het uitvoeren van de TBARS-test zonder een dure kit is beschikbaar in de literatuur.

Hier rapporteren we een gedetailleerde, analytisch gevalideerde methodologie voor doeleinden over het uitvoeren van een TBARS-test op een eenvoudige, reproduceerbare en goedkope manier. Veranderingen in de lipideperoxidatie van menselijk serum, HepG2-lysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid bij behandeling met Cu(II)-ionen worden aangetoond als illustratieve toepassingen voor de TBARS-test. De resultaten tonen aan dat deze TBARS-test consistent en reproduceerbaar is op een dagelijkse basis.