Un approccio da banco all'apertura della barriera ematica specifica della posizione utilizzando ultrasuoni focalizzati in un modello di ratto
Summary
Gli ultrasuoni focalizzati con agenti microbolli possono aprire la barriera ematica in modo focale e transitorio. Questa tecnica è stata utilizzata per fornire una vasta gamma di agenti attraverso la barriera eencefalica. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la consegna localizzata al cervello del roditore con o senza guida per la risonanza prima.
Abstract
La chirurgia stereotassica è il gold standard per la somministrazione localizzata di farmaci e geni al cervello dei roditori. Questa tecnica ha molti vantaggi rispetto alla consegna sistemica, tra cui una localizzazione precisa in una regione cerebrale bersaglio e la riduzione degli effetti collaterali fuori bersaglio. Tuttavia, la chirurgia stereotassica è altamente invasiva, il che limita la sua efficacia traslizionale, richiede lunghi tempi di recupero e fornisce sfide quando si prendono di mira più regioni cerebrali. Gli ultrasuoni focalizzati (FUS) possono essere utilizzati in combinazione con microbolle circolanti per aprire transitoriamente la barriera emiencefalica (BBB) in regioni di dimensioni millimetriche. Ciò consente la localizzazione intracranica di agenti forniti sistemicamente che normalmente non possono attraversare la BBB. Questa tecnica fornisce un’alternativa non invasiva alla chirurgia stereotassica. Tuttavia, ad oggi questa tecnica deve ancora essere ampiamente adottata nei laboratori di neuroscienze a causa del limitato accesso alle attrezzature e ai metodi standardizzati. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un approccio da banco all’apertura FUS BBB (BBBO) che sia conveniente e riproducibile e possa quindi essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio.
Introduction
Nonostante le numerose scoperte nelle neuroscienze di base, il numero di trattamenti emergenti per i disturbi neurosviluppo e neurodegenerativirimane relativamente limitato 1,2. Una comprensione più profonda dei geni, delle molecole e dei circuiti cellulari coinvolti nei disturbi neurologici ha suggerito trattamenti promettenti irrealizzabili nell’uomo con le tecniche attuali3. I trattamenti efficaci sono spesso limitati dalla necessità di essere penetrabili cerebralmente e specifici del sito4,5,6,7,8. Tuttavia, i metodi esistenti di somministrazione localizzata di farmaci in specifiche regioni cerebrali (ad esempio, parto tramite iniezione o cannula) sono invasivi e richiedono un’apertura da fare nel cranio9. L’invasività di questo intervento previene l’uso di routine del parto localizzato nel cervello umano. Inoltre, i danni ai tessuti e le conseguenti risposte infiammatorie sono onnipresenti confondimenti per studi di base e preclinici che si basano sull’iniezione intracerebrale10. La capacità di fornire in modo non invasivo agenti attraverso la barriera epatica (BBB) e indirizzarli verso specifiche regioni cerebrali potrebbe avere un enorme impatto sui trattamenti per i disturbi neurologici, fornendo allo stesso tempo un potente strumento investigativo per la ricerca preclinica.
Un metodo di trasporto mirato attraverso la BBB con danni minimi ai tessuti è l’ecografia transcranici focalizzata (FUS) insieme alle microbolle per aprire focalmente e transitoriamente la BBB11,12,13,14,15,16. L’apertura della FUS BBB ha attirato la recente attenzione per il trattamento dei disturbi neurodegenerativi, dell’ictus e del glioma localizzando le terapie per colpire le regioni cerebrali come i fattorineurotrofici 17,18,19,le terapie geniche20,21,22,anticorpi 23,neurotrasmettitori24e nanoparticelle25,26,27,28,29. Con la sua vasta gamma di applicazioni e la sua natura non invasiva30,31, l’aperturaFUS BBB è un’alternativa ideale alle iniezioni intracranici stereotassiche di routine. Inoltre, a causa del suo uso attualenell’uomo 30,32, le indagini precliniche che utilizzano questa tecnica possono essere considerate altamente trasmissizionali. Tuttavia, l’apertura della FUS BBB deve ancora essere una tecnica ampiamente consolidata nella scienza di base e nella ricerca preclinica a causa della mancanza di accessibilità. Pertanto, forniamo un protocollo dettagliato per un approccio da banco all’apertura di FUS BBB come punto di partenza per i laboratori interessati a stabilire questa tecnica.
Questi studi sono stati condotti con un trasduttore ad ultrasuoni specifico FUS ad alta potenza o con un trasduttore ad immersione ad ultrasuoni focalizzato a bassa potenza. I trasduttori erano azionati da un amplificatore di potenza RF progettato per carichi reattivi e da un generatore di funzioni da banco standard. I dettagli per questi articoli sono disponibili nella tabella dei materiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un approccio da banco all’apertura assistita da microbolle FUS BBB con approcci alternativi tra cui due diversi trasduttori e metodi per il targeting intracraniciale con e senza guida mri. Attualmente, al fine di stabilire l’apertura FUS BBB guidata dalla risonanza prima di MRI in laboratorio, c’è la possibilità di acquistare eccellenti dispositivi pronti all’uso che forniscono risultati altamente standardizzati e riproducibili con interfacce intuitive. Tuttavia, molti laboratori non sono preparat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte da una sovvenzione NSF EPSCoR Research Infrastructure alla Clemson University (1632881). Inoltre, questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Gli autori riconoscono con gratitudine l’uso dei servizi e delle strutture dell’Università dell’Alabama a Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Gli autori riconoscono Rajiv Chopra per il suo sostegno e la sua guida.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
References
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