Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması
Summary
Erken fare embriyolarında mikroRNA’ların profilini çıkarmak için bir teknik tanımladık. Bu protokol, düşük hücre girişi ve küçük RNA zenginleştirme zorluğunun üstesinden gelebiliyor. Bu tsay erken fare embriyofarklı hücre soylarında zaman içinde miRNA ifade değişiklikleri analiz etmek için kullanılabilir.
Abstract
MikroRNA’lar (miRNA’lar) hücre kaderi kararlarının ve gelişimsel zamanlamanın karmaşık düzenlenmesi için önemlidir. Erken gelişim sırasında miRNA’ların katkısının in vivo çalışmaları, sınırlayıcı hücre sayısı nedeniyle teknik olarak zordur. Ayrıca, birçok yaklaşım kuzey blotting, mikrodizi ve qPCR gibi tahlillerde tanımlanması ilgi bir miRNA gerektirir. Bu nedenle, birçok miRNA’nın ve onların isoformlarının ekspresyonu erken gelişim sırasında incelenmemiştir. Burada, nöral krest hücrelerinin erken popülasyonlarında miRNA’ların nispeten tarafsız profilini çıkarmak için erken fare embriyolarından sıralanmış hücrelerin küçük RNA dizilimi için bir protokol gösteriyoruz. Kütüphane hazırlığı sırasında amplifikasyon ve jel bazlı arınma kullanarak düşük hücre girişi ve boyut seçiminin zorluklarının üstesinden çıkıyoruz. Embriyonik yaşı, kopyalar arasındaki varyasyonun değişken bir muhasebesi olarak tanımlarız ve biyolojik kopyalarda miRNA’ları doğru bir şekilde profillemek için sahne eşlenen fare embriyoları kullanılmalıdır. Sonuçlarımız, bu yöntemin diğer hücre soylarından miRNA’ların ekspresyonunun profiline geniş ölçüde uygulanabileceğini göstermektedir. Özetle, bu protokol miRNA’ların erken fare embriyosu farklı hücre soylarındaki gelişim programlarını nasıl düzenlediğini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Gelişim biyolojisinin temel sorusu, tek bir farklılaşmamış hücrenin çok sayıda karmaşık hücre tipine sahip bütün bir organizmaya nasıl yol abildiğidir. Embriyogenez sırasında, organizmalar geliştikçe hücrelerin gelişim potansiyeli giderek kısıtlanır. Bir örnek nöral krest soy, giderek periferik nöronlar gibi çeşitli terminal türevleri içine multipotent hücre popülasyonundan ayırt, glia, kranial kemik, ve kıkırdak. Nöral krest hücreleri gastrulation sırasında ektoderm belirtilir ve daha sonra mezenkimal geçiş için bir epitel geçmesi ve ölümcül ayırt edecek vücut boyunca ayrık yerlere embriyo ile göç1. Onlarca yıllık çalışmalar transkripsiyonel gen düzenleyici ağ ortaya çıkardı, ancak nöral krest gelişiminin zamanlamasını kontrol post-transkripsiyonel düzenleme mekanizmaları hakkında çok daha az bilinmektedir.
Önceki çalışma mikroRNA ‘lar (miRNA’lar) uygun gelişimsel zamanlama ve hücre kaderikararları2,3,4,5,6için gen ekspresyonunu bastırmak olduğunu göstermektedir . Nöral krest gelişiminde miRNA çalışmaları büyük ölçüde kraniyofasiyal gelişimin sonraki aşamalarına odaklanmıştır. Örneğin, miR-17 ~92 ve miR-140 fare ve zebra balığıkrayon gelişimi sırasında palatogenez için kritik, sırasıyla7,8. MiRNA’ların embriyonun ilk nöral krest kader kararlarına katkısı tam olarak araştırılmamıştır. Erken kader kararlarında miRNA’lar üzerinde yapılan çalışmalar, erken embriyolarda bulunan düşük hücre sayısı gibi teknik zorluklarla sınırlandırılmıştır.
MiRNA’lar erken fare gelişimimodelinefarklı aşamalarında embriyoid cisimler kullanılarak hücre hatlarından in vitro profilli olmuştur 9 . Erken memeli gelişimi sırasında vivo küçük RNA’ların araştırılması nispeten sınırlı olmuştur. QPCR, microarrays ve kuzey lekeleri10gibi yöntemlerde belirli bir miRNA ekspresyonu analiz etmek için kullanılan bilinen bir dizi olarak profil miRNA’lar için önceki yöntemler önyargı yol açmıştır. Yeni nesil sıralama ve hiç moleküler araçlar iyileştirilmesi şimdi erken memeli gelişimi ve hücre kaderi kararlarına katkılarını incelemek için miRNA ifade nispeten tarafsız analizi için izin verir.
Burada, gastrulation (E7.5) organogenezin in başına kadar erken fare embriyolarından (E7.5) nöral krest hücrelerinde ifade edilen küçük RNA’ların hasat ve dizilimi için bir teknik (E9.5) rapor ediyoruz. Bu teknik basittir ve yeni nesil sıralama için en az sayıda hücreden küçük RNA sıralama kitaplıkları hazırlamak için soy izleme, hücre sıralama ve jel tabanlı boyut seçimi birleştirir. Erken gelişimin hızlı değişimleri sırasında miRNA’ların kapsamlı bir görünümünü elde etmek için 6 saatlik zaman aralıklarını çözmek için embriyoların katı somit evre sinin eşleştirilmesinin önemini vurguluyoruz. Bu yöntem genetik ve gelişimsel çalışmalara yaygın olarak uygulanabilir ve embriyoların biraraya gelebisini önler. Jel bazlı arınma, kütüphane nicelemesi ve PCR’den getirilen önyargıyı en aza indirme kullanarak miRNA zenginleştirme gibi mevcut yöntemlerin zorluklarının üstesinden gelmenin bir yolunu tanımlıyoruz. Bu yöntem, miRNA’ların fare embriyolarının nöral krest soyundan gelişimsel zamanlamayı nasıl kontrol ettiğine çalışmak için zaman içinde miRNA ifade modellerini tanımlamak için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gelişimsel süreçler hızla ilerleyebilir ve hücreler miRNA’ların erken kader kararlarına katkıda bulunan kapsamlı bir görünümünü yakalamak için yaygın olarak kullanılan yarım günlük artıştan daha spesifik evreleme gerektiren birçok sıralı spesifikasyondan geçmektedir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada Theiler evre 12 embriyolar olan 3 ila 6 somites11sahip Arasında RNA sıralama yaptı. Biz bu süre boyunca, nöral krest hücreleri belirtilir (3 yaş somites), delaminate (4 yaş somites), ve göç (5-6 yaş somites). Ayrıca hücre popülasyonlarını takip etmek için kullanılan Cre-driver’ın yanı sıra, yaşın biyolojik örnekler arasındaki en büyük varyasyon kaynağı olduğunu ve sadece somit uyumlu embriyoların kopya olarak düşünülmesi gerektiğini görüyoruz. Transgenik embriyolar ile yabani tip kontrolleri karşılaştırılırken de bu göz önünde bulundurulmalıdır.
Erken gelişim sırasında profil miRNA’lar için önceki yöntemler küçük RNA sıralama kütüphane hazırlama için RNA girişi 10-100 ng arasında kullanmış ve bir örnek içine birden fazla embriyo havuzlu var13,14. RNA izolasyonunu ve kütüphane hazırlığını tek bir E7.5 embriyosu veya E8.5 ve E9.5’teki sıralanmış nöral krest hücrelerinden toplam RNA’nın yaklaşık 100 ng’sini girdi olarak kullanarak gösteriyoruz. Embriyoları sıralamak için ayrıştırırken, bir mikroskop altında ayrışma izlemek ve tek hücre elde edildiğinde gözlemlemek için reaksiyon söndürmek dikkat etmelisiniz. E8.5-E9.5 embriyolarının kranial bölgesinin kopması protokolde açıklandığı gibi nazik manuel pipetleme ile neredeyse anında olduğunu görüyoruz. Daha büyük dokular ve giderek daha yaşlı embriyolar için, ayrışma süresi embriyonun ayrıştırılan kısmına bağlı olarak daha uzun olabilir. E7.5-E9.5 embriyoları için mikroskop altında hücre kümeleri kolayca görülebilir ve daha fazla küme ler görünene kadar bölünme devam etmelidir. 5-10x arasında herhangi bir yerde de çözüm aracılığıyla odak ayarlarsanız tek hücreler çözüm görünür. Önceki yöntemler, kütleli RNA’yı düşük sayıdaki hücreden hazırlamak için RNA sıralaması için hücreleri doğrudan lysis arabelleği olarak sıralar14. Burada, kütüphane hazırlığı başlamadan önce RNA’nın izole edilebilmeleri için doğrudan RNA çıkarma lysis çözeltisine sıralıyoruz. 11 μL elüsyon hacmine sahip mini sütunların kullanımı, tek bir RNA hazırlığının küçük RNA ve toplu RNA sıralaması arasında bölünebileceği kadar yüksek bir RNA konsantrasyonuna izin verdi.
En küçük RNA sıralama yöntemlerinin güncel sınırlamalarından biri, dönüştürülmüş cDNA’nın PCR amplifikasyonudur. Yöntemimiz bu sınırlamanın üstesinden gelmez, ancak önerilen maksimum 25 döngüden 16 döngüye kadar PCR döngülerinin sayısını en aza indirebildik. Amplifikasyondaki bu azalma PCR tarafından sunulan yapay amplifikasyon önyargılarını azaltır. Bir diğer sapma kaynağı da bağdaştırıcıların ve miRNA’ların uçlarında bulunan belirli dizilerin diğer dizilere göre daha fazla verimlilikle bir araya gelebildiği bilinmektedir. Bunu önlemek için, bu protokolde kullanılan bağdaştırıcılar ligasyon reaksiyonlarında önyargıyı önlemek için her bağdaştırıcının sonunda 4 rasgele baz almıştır. Ayrıca, başka bir ortak sorun RNA girişi düşük olduğunda oluşturan bağdaştırıcı dimers miktarıdır. Kütüphane hazırlama kiti, her ligasyondan sonra fazla bağdaştırıcıları kaldırmak için adaptör inaktivasyonu ve boncuk temizleme gibi adaptör dimer oluşumunu azaltmak için adımlar içerir. Ayrıca 3′ ve 5′ 4N adaptörleri 1/4 oranında seyrelterek oluşabilen bağdaştırıcı dimer miktarını azalttık. Seyreltilmediğinde, 130 bp bant yoğunluğunun arttığını ve bir jel üzerinde istenilen küçük RNA kitaplıklarını içeren 150 bp bandından ayırt etmeyi zorlaştırdığını bulduk.
Sıralama kitaplıklarını hazırlamanın bir diğer güncel zorluğu da sıralamadan önce ürünün doğru niceliğidir. Farklı yöntemlerin aynı kütüphanede farklı sonuçlar verdiğini bulduk. Araştırmacıların konsantrasyonu doğru tahmin etmek için birden fazla nicelik metodlarını kullanmalarını öneriyoruz.
Bu protokol yaygın olarak genetik, gelişimsel çalışmalara veya RNA’nın düşük sayıda hücreden hasat edildiği diğer uygulamalara uygulanabilir. Bu yaklaşım, embriyoların biraraya gelmekten kaçınarak zamansal çalışmaları basitleştirir ve hem sıralanmış hem de sıralanmış hücrelere kolayca uygulanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Andrew McDonough B+ Vakfı ve NIH (R01-HD099252, R01-HD098131) tarafından desteklendi. R.J.P. Kanser Araştırmaları (RR150106) cprit bursu ve Kanser Araştırmaları (V Vakfı) V Bursu üyesidir. Yazarlar ayrıca bu proje için gerekli ekipman sağlamak için BCM de Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek kabul etmek istiyorum.
Materials
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
