Zuivering van fibroblasten en Schwann cellen van sensorische en motorische zenuwen in Vitro
Summary
Hier presenteren we een methode om fibroblasten en Schwann cellen te zuiveren van zintuiglijke en motorische zenuwen in vitro.
Abstract
De belangrijkste cellen in het perifere zenuwstelsel zijn de Schwann cellen (SCs) en de fibroblasten. Beide cellen duidelijk uitdrukken de sensorische en motorische fenotypes die betrokken zijn bij verschillende patronen van neurotrofe factor genexpressie en andere biologische processen, die zenuwregeneratie. De huidige studie heeft een protocol vastgesteld om zeer gezuiverde rattensensorische en motorische SC’s en fibroblasten sneller te verkrijgen. De ventrale wortel (motorische zenuw) en de rugwortel (sensorische zenuw) van neonatale ratten (7 dagen oud) werden gescheiden en de cellen werden gedurende 4-5 dagen gekweekt, gevolgd door isolatie van sensorische en motorische fibroblasten en SCs door differentiële spijsvertering en differentiële therapietrouwmethoden sequentieel te combineren. De resultaten van immunocytochemie en flow cytometrieanalyses toonden aan dat de zuiverheid van de sensorische en motorische SCs en fibroblasten >90% was. Dit protocol kan worden gebruikt om een groot aantal sensorische en motorische fibroblasten / SCs sneller te verkrijgen, wat bijdraagt aan de exploratie van sensorische en motorische zenuwregeneratie.
Introduction
In het perifere zenuwstelsel, de zenuwvezels bestaat voornamelijk uit axonen, Schwann cellen (SCs), en fibroblasten, en bevat ook een klein aantal macrofagen, microvasculaire endotheelcellen, en immuuncellen1. SCs wikkel de axonen in een 1:1 verhouding en zijn omsloten door een bindweefsel laag genaamd de endoneurium. De axonen worden vervolgens gebundeld om groepen genaamd fascicles vormen, en elke fascicle is verpakt in een bindweefsel laag bekend als het perineurium. Ten slotte is de hele zenuwvezel verpakt in een laag bindweefsel, dat wordt aangeduid als het epineurium. In het endoneurium bestaat de hele celpopulatie uit 48% SC’s, en een aanzienlijk deel van de resterende cellen omvat fibroblasten2. Bovendien zijn fibroblasten belangrijke componenten van alle zenuwcompartimenten, waaronder het epineurium, het perineurium en het endoneurium3. Veel studies hebben aangetoond dat SC’s en fibroblasten een cruciale rol spelen in het regeneratieproces na perifere zenuwletsels4,5,6. Na de transsectie van de perifere zenuw regelen de perineuriale fibroblasten celsorde via de ephrin-B/EphB2-signaleringsroute tussen SC’s en fibroblasten, waardoor de axonale hergroei door wonden verder wordt geleid5. Perifere zenuwfibroblasten scheiden tenascin-C-eiwit af en verbeteren de migratie van SC’s tijdens zenuwregeneratie via β1-integrin signaleringsroute7. Echter, de SCs en fibroblasten gebruikt in de bovenstaande studies werden afgeleid van de heupzenuw, die zowel sensorische en motorische zenuwen omvat.
In het perifere zenuwstelsel voeren de sensorische zenuwen (afferente zenuwen) zintuiglijke signalering uit van de receptoren naar het centrale zenuwstelsel (CNS), terwijl de motorische zenuwen (efferent zenuwen) signalen van het CNS naar de spieren geleiden. Eerdere studies hebben aangetoond dat SCs duidelijke motorische en zintuiglijke fenotypes uitdrukken en neurotrofe factoren afscheiden ter ondersteuning van perifere zenuwregeneratie8,9. Volgens een recente studie, fibroblasten ook uitdrukken verschillende motorische en zintuiglijke fenotypes en invloed op de migratie van SCs10. Zo stelt de verkenning van verschillen tussen motorische en sensorische zenuwfibroblasten/SC’s ons in staat om de ingewikkelde onderliggende moleculaire mechanismen van perifere zenuwspecifieke regeneratie te bestuderen.
Op dit moment zijn er vele manieren om SCs en fibroblasten te zuiveren, waaronder de toepassing van antimitotische agentia, antilichaamgemedieerde cytolyse11,12, sequentiële immunopanning13 en laminine substratum14. Echter, alle bovenstaande methoden verwijderen fibroblasten en het behoud van alleen de SCs. Zeer gezuiverde SCs en fibroblasten kunnen worden verkregen door flow cytometrie sorteertechnologie15, maar het is een tijdrovende en kostbare techniek. Vandaar, in deze studie, een eenvoudige differentiële spijsvertering en differentiële therapietrouw methode voor het zuiveren en isoleren van zintuiglijke en motorische zenuwfibroblasten en SCs werd ontwikkeld om een groot aantal fibroblasten en SCs sneller te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De twee belangrijkste celpopulaties van perifere zenuwen opgenomen SCs en fibroblasten. De voornamelijk gekweekte fibroblasten en SCs kunnen nauwkeurig helpen bij het modelleren van de fysiologie van fibroblasten en SCs tijdens perifere zenuwontwikkeling en regeneratie. De studie toonde aan dat P7 rattensciatische zenuwcellen ongeveer 85% van de S100-positieve SC’s, 13% van de OX7-positieve fibroblasten en slechts 1,5% van de OX42-positieve macrofagen13bevatten. Hoewel het aantal fibroblasten lage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), de National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
