In vivo быстрое фотохимическое окисление белков (IV-FPOP) является гидроксиль радикальным протеином, который позволяет картировать структуру белка в их родной среде. Этот протокол описывает сборку и настройку системы микрофлюидирования IV-FPOP.
Быстрое окисление белков (FPOP) является гидроксиловрадикальным протеиновым протеиновым методом, используемым для изучения структуры белка, белково-лигандовых взаимодействий и белково-белковых взаимодействий. FPOP использует эксимерный лазер KrF на уровне 248 нм для фотолиза перекиси водорода для генерации гидроксилевых радикалов, которые, в свою очередь, окисляют доступные аминокислотные боковые цепи растворителя. Недавно мы расширили использование FPOP in vivo окислительной маркировки в Caenorhabditis elegans (C. elegans), озаглавленный IV-FPOP. Прозрачные нематоды используются в качестве модельных систем для многих заболеваний человека. Структурные исследования в C. elegans IV-FPOP возможны из-за способности животного унифицировать перекись водорода, их прозрачности к лазерному облучению на 248 нм, и необратимого характера модификации. В настоящем и сводке микрофлюидной системы потока для маркировки IV-FPOP, параметров IV-FPOP, экстракции белка и ОПтимизированных параметров LC-MS/MS.
Белок следы в сочетании с масс-спектрометрии (MS) был использован в последние годы для изучения белковых взаимодействий и конформационных изменений. Гидроксил радикальный белок след (HRPF) методы зонд белка платежеспособность доступности путем изменения белка аминокислоты боковых цепей. Метод HRPF, быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP)1, был использован для зондирования структуры белка в пробирке2, в клетке (IC-FPOP)3, и совсем недавно in vivo (IV-FPOP)4. FPOP использует 248 нм эксимерный лазер длиной волны для того, чтобы быстро генерировать гидроксиловые радикалы путем фотолиза перекиси водорода, чтобы сформировать гидроксиловые радикалы1. В свою очередь, эти радикалы могут маркировать 19 из 20 аминокислот в микросекундной временной шкале, быстрее, чем белки могут разворачиваться. Хотя реактивность каждой аминокислоты с гидроксиловыми радикалами простирается в 1000 раз, можно нормализовать окисление боковой цепи, вычислив защитный фактор (ПФ)5.
Так как FPOP может окислительно модифицировать белки независимо от их размера или первичной последовательности, это оказывается выгодным для в-клеточных и in vivo исследований белка. IV-FPOP зондирует структуру белка в C. elegans подобно in vitro и в клетке исследования4. C. elegans являются частью семейства нематод и широко используются в качестве модели для изучения заболеваний человека. Способность червя унифицировать перекись водорода как пассивной, так и активной диффузией позволяет изучать структуру белка в различных системах организма. Кроме того, C. elegans подходят для IV-FPOP из-за их прозрачности на 248 нм лазерной длины волны, необходимой для FPOP6. Присоединение этого метода к масс-спектрометрии позволяет выявить несколько модифицированных белков с использованием традиционных подходов протеомики снизу вверх.
В этом протоколе мы описываем, как выполнять IV-FPOP для анализа структуры белка в C. elegans. Экспериментальный протокол требует сборки и настройки микрофлюидной системы потока для IV-FPOP, адаптированной из Konermann et al7. После IV-FPOP образцы гомогенизированы для извлечения белка. Образцы белков протеолиза и пептиды анализируются с помощью жидкого хроматографа (LC) тандема MS, а затем количественной оценки.
Текущий ориентир для изучения in vivo белково-белковых взаимодействий (PPI) является флуоресценция резонансной передачи энергии (FRET). В своей самой простой форме, этот метод исследования PPI по передаче энергии между двумя молекулами, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга15. В отличие от методов MS, FRET не имеет разрешения для характеристики конформантарных изменений и мест взаимодействия на аминокислотном уровне. МЕТОДы ms на основе все чаще используются для изучения ИЦП16. IV-FPOP является методом HRPF, который позволяет для инвиво-белка структурного анализа в C. elegans. Для того, чтобы успешно маркировать C. elegans IV-FPOP, важно правильно собрать микрофлюидную систему потока, чтобы уменьшить потерю образца. 250 мкм i.d. капилляр показал, чтобы максимизировать восстановление образца по сравнению с меньшими i.d. капилляры4. Большие i.d. капилляры не были протестированы, однако микрофлюидная система потока разработана с использованием капилляра с тем же i.d. как коммерчески доступная система цитометрии потока для сортировки C. elegans. 17 Размер выборки червя также имеет важное значение, размер выборки менее 10 000 евро за образец до того, как FPOP не дает концентраций белка, достаточно высоких для анализа LC-MS/MS. Более высокие размеры образцов (10 000 червей) также могут быть использованы путем корректировки начального стартового объема (шаг 4.5).
Важнейшее значение имеет правильное собрание микрофлюидной системы потока. Утечки в образец пути привести к несовместимым потоком червей или H2O2. Феррулес, рукава и 3-2 клапана могут быть использованы повторно из нескольких iv-FPOP экспериментов, если правильно очищены после каждого эксперимента. Тем не менее, мы рекомендуем собрать новую микрофлюидную систему потока для каждой биологической репликации. Если микрофлюитика правильно собрана, черви и H2O2 будут смешиваться на смешивании-T с минимальным давлением спины. В качестве контроля качества (КК) микрофлюидной системы потока, мы рекомендуем проверить эффективность смешивания с помощью цветных красителей. Важно контролировать движение магнитных мешалки внутри шприца червя во время IV-FPOP, неправильного смешивания образцов на шприц червя или смешивания-T может привести к обратно давление вызывает утечки. Кроме того, плохие условия смешивания приводят к большим потерям образцов, плохому лазеровому воздействию червей в лазерном окне и засорению.
C. elegans техническое обслуживание важно для того, чтобы уменьшить фоновое окисление. Мы рекомендуем выращивать червей при низких температурах при низких стрессовых условиях, так как высокие температуры могут повлиять на полное окисление фона. Контрольный набор проб только червей, нет H2O2 и не лазерное облучение, рекомендуется для всех IV-FPOP экспериментов для учета фонового окисления из-за лабораторного обслуживания. Одним из нынешних ограничений этого метода является общее количество идентифицированных окислительно модифицированных пептидов и общее количество остатков, окисленных на пептид, чтобы получить более высокую структурную информацию о белка. Хотя это и не рекомендуется, увеличение окислительных модификаций может быть достигнут за счет использования более высоких концентраций перекиси водорода. Увеличение перекиси водорода может значительно изменить важные биологические пути, а также привести к окислению индуцированной разворачивается. Если концентрация перекиси водорода для IV-FPOP увеличена, рекомендуется проверить жизнеспособность червя и фоновое окисление, так как концентрации выше 200 мМ не были протестированы.
Описанный протокол LC-MS/MS может быть оптимизирован и изменен в соответствии с MS КК других лабораторий. Использование 2D-хроматографии методы ранее было показано, чтобы увеличить идентификацию окислительно модифицированных пептидов и белков18. Тем не менее, методы обогащения белка, которые нацелены на конкретный белок, представляющий интерес, не рекомендуются, в том числе, но не ограничивались выпадениями антител или выдвижной анализы. Эти методы могут смещения к одному конформеру белка, если эпитоп / связывание сайт белка был окислительно изменен IV-FPOP. Новые разработки в области следов радикальных реагентов, таких как сульфат радикальный анион10 или трифторметилирование19 может увеличить универсальность IV-FPOP. Хотя единственным реагентом маркировки, испытанным в vivo, является перекись водорода, другие лазерные радикалы могут быть оптимизированы. Использование других радикалов должно быть совместимым с жизнеспособностью червя, проницаемой клеткой, и 248 нм лазерной длины волны. Благодаря использованию C. elegans в качестве модели системы для многих заболеваний человека, IV-FPOP имеет потенциал, чтобы иметь сильное влияние в изучении роли структуры белка в патогенезе болезни.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана стартовыми фондами Из Университета Мэриленда, Балтимора и NIH 1R01 GM 127595, присужденной LMJ. Авторы благодарят доктора Даниэля Дереджа за помощь в редактировании рукописи.
15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |