Металл-ограниченный рост Neisseria gonorrhoeae для характеристики Металл-ответственных генов и приобретения металла от Хост Лигандс

Neisseria gonorrhoeae вызывает распространенную инфекцию, передаемую половым путем, гонореей. Во время инфекции, патогенные Neisseria выразить репертуар металл-чувствительных генов, которые позволяют бактериям преодолеть усилия ограничения металла человека хозяина^1,2,3. След металлов, как железо и цинк играют ключевую роль во многих клеточных процессов, таких как связывание с ферментами в каталитических участках, участие в редокс реакции, и как структурные факторы в различных белков^4,5. В метал-ограниченных условиях, металл-реагируя loci derepressed и их резцирующие протеины могут помочь присваивать эти питательные вещества. Характеристика этих генов и белков представляет собой уникальную техническую задачу для исследователя. Ионы металла должны быть удержаны от бактерий, чтобы вызвать транскрипцию этих генов из их родной локусы, но эффективное хелатора этих ионов из металлических носителей может быть трудно оптимизировать. Различные металлические профили исходной воды и присущие много-много вариации⁶ порошкообразных ингредиентов означает, что количество хелатора, необходимых для удаления конкретного металла из богатой среде будет варьироваться в зависимости от различных местах, ингредиент поставщиков, и даже с течением времени в рамках одной лаборатории, как химический инвентарь заменяется.

Чтобы обойти эту задачу, мы описываем подготовку определенной среды, которая обрабатывается с помощью моли chelex-100 во время подготовки к удалению следов металлов из раствора. Эта среда является достаточно питательной плотной, чтобы обеспечить рост гонококка, который трудно культуры за пределами человеческого хозяина, и позволяет следователю ввести конкретный профиль металла путем добавления своих собственных определенных источников и концентраций Металлов. Метод контролируемого дополнения желаемых металлов к истощению среды увеличивает экспериментальную консистенцию и позволяет проводить надежные, воспроизводимые эксперименты независимо от таких факторов, как источник воды и химические номера лотов. Кроме того, эти носители могут быть развернуты как жидкость или твердые только с незначительными изменениями, что делает его довольно универсальным.

Для того, чтобы продемонстрировать полезность этой среды, мы наметили протокол для его использования для гонококкового роста и описать три успешных эксперимента для характеристики металлоотвечающего генов Neisseria. Во-первых, мы готовим гонококковые цельноклеточные лизаты из истощенных металлом или дополненных культур и демонстрируем переменные уровни производства белка из металлочувствительных локусов. Затем мы наметили цинк-ограниченный обзор роста, в котором гонококковый рост контролируется добавками конкретных, пригодных для использования источников цинка. Наконец, мы показываем связывающие анализы, которые демонстрируют целые гонококковые клетки, выражающие металлореакционные поверхностные рецепторы, связывающиеся с их соответствующими металлосодержащих лигандами. Успешное поверхностное представление этих рецепторов требует роста в металло-обеденный среды.

Настоящий протокол был оптимизирован специально для Neisseria gonorrhoeae, но многие другие бактериальные патогены используют стратегии приобретения металла во время инфекции⁷, так что этот протокол может быть адаптирован для изучения металла гомеостаза в других бактерий. Оптимизация этого носителя и этих экспериментальных протоколов для использования в других бактериях, скорее всего, потребует незначительной модификации концентрации металлического хелатора и/или времени лечения с Chelex-100, так как другие бактерии могут иметь несколько иные требования к металлу, чем у гонококка. Утюг и цинк являются основными металлами, вызывающими озабоченность в связи с описанными исследованиями, но другие металлы (например, марганец) были продемонстрированы как критические для бактерий, в том числе Neisseria^8,9,10,11,12. Кроме того, аналогичные методы были описаны для характеристик металла в работе эукариотической клеточной культуры, которые также могут быть рассмотрены. ^{13 Год}