Croissance limitée des métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux auprès de l’hôte Ligands

Neisseria gonorrhoeae provoque l’infection sexuellement transmissible commune gonorrhée. Pendant l’infection, Neisseria pathogène exprimer un répertoire de gènes métal-sensibles qui permettent aux bactéries de surmonter les efforts de restriction de métal par l’hôte humain^1,2,3. Les métaux traces comme le fer et le zinc jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, tels que la liaison aux enzymes dans les sites catalytiques, la participation aux réactions redox, et comme facteurs structurels dans diverses protéines^4,5. Dans des conditions de métal limité, les loci métal-sensibles sont déprimés et leurs protéines résultantes peuvent aider à l’acquisition de ces éléments nutritifs. La caractérisation de ces gènes et protéines représente un défi technique unique pour le chercheur. Les ions métalliques doivent être retenus contre les bactéries afin d’induire la transcription de ces gènes à partir de leurs loci indigènes, mais la chélation efficace de ces ions à partir de médias chargés de métal peut être difficile à optimiser. Les différents profils métalliques de l’eau de source et la variation inhérente du lot au lot⁶ des ingrédients en poudre signifient que la quantité de chélateur nécessaire pour enlever un métal spécifique d’un milieu riche variera d’un endroit à l’autre, les vendeurs d’ingrédients, et même au fil du temps dans un seul laboratoire à mesure que l’inventaire chimique sera remplacé.

Pour contourner ce défi, nous décrivons la préparation d’un milieu défini qui est traité avec de la résine Chelex-100 pendant la préparation pour enlever les métaux traces de la solution. Ce milieu est suffisamment dense en nutriments pour permettre la croissance du gonocoque, qui est difficile à culture en dehors de l’hôte humain, et permet à l’investigateur d’introduire un profil métallique spécifique en additionnant leurs propres sources et concentrations définies de Métaux. La méthode d’addition contrôlée des métaux désirés au milieu appauvri augmente la consistance expérimentale et permet des expériences robustes et reproductibles indépendamment de facteurs tels que la source d’eau et le nombre de lot séchimique. En outre, ce support peut être déployé comme un liquide ou solide avec seulement des modifications mineures, ce qui le rend assez polyvalent.

Afin de démontrer l’utilité de ce milieu, nous énonçons un protocole pour son utilisation pour la croissance gonococcique et déécrivons trois expériences réussies pour caractériser les gènes de Neisseria sensibles aux métaux. Tout d’abord, nous préparons des lysates gonococciques à cellules entières à partir de cultures appauvries ou complétées par le métal et démontrons des niveaux variables de production de protéines à partir de loci sensibles au métal. Nous cifrayons alors un assay de croissance zinc-restreint dans lequel la croissance gonococcique est commandée par la supplémentation des sources spécifiques et utilisables de zinc. Enfin, nous montrons des essais de liaison qui démontrent des cellules gonococciques entières exprimant des récepteurs de surface sensibles au métal se liant à leurs ligands contenant du métal respectifs. La présentation réussie de surface de ces récepteurs exige la croissance dans le milieu métal-appauvri.

Le protocole actuel a été optimisé spécifiquement pour Neisseria gonorrhoeae, mais de nombreux autres agents pathogènes bactériens utilisent des stratégies d’acquisition de métaux pendant l’infection⁷, de sorte que ce protocole peut être adapté pour l’étude de l’homéostasie métallique dans d’autres bactéries. L’optimisation de ce média et de ces protocoles expérimentaux pour une utilisation dans d’autres bactéries nécessitera probablement une légère modification des concentrations de chélateurs métalliques et/ou du temps de traitement avec Chelex-100, car d’autres bactéries peuvent avoir des besoins métalliques légèrement différents de ceux du gonocoque. Le fer et le zinc sont les principaux métaux préoccupants pour les enquêtes décrites, mais d’autres métaux (p. ex., le manganèse) ont été démontrés comme critiques pour les bactéries, y compris Neisseria^8,9,10,11,12. En outre, des méthodes similaires ont été décrites pour les caractérisations métalliques dans le travail de culture cellulaire eucaryotique, qui peut également être considérée. ^{13 (en)}