Assemblage et caractérisation des Micelles complexes polyélectrolytes

Lorsque les polyélectrolytes chargés en face sont mélangés dans une solution aqueuse, le gain d’entropie de la libération de leurs contreions provoque le démêlage de la solution dans une phase condensée riche en polymères et un supernatant appauvri en polymère^1,2,3,4,5, un phénomène connu sous le nom de complexe polyélectrolyte. Si un bloc hydrophile neutre est conjugué à l’un ou les deux polyélectrolytes, la séparation de phase à l’échelle nanométrique se produit plutôt (figure 1A). Les nanoparticules auto-assemblées de noyau-coquille résultantes sont diversement appelées micelles complexes de polyélectrolyte (PCMs), micelles complexes de polyion, complexes d’ionomère de bloc, ou micelles coacervate-noyau par analogie à la micellation surfactant, même si tous les composants du système sont hydrophiles^6,7. La capacité d’un PCM à encapsuler des molécules hydrophiles telles que les protéines et les acides nucléiques, ainsi que la tunabilité étendue offerte par l’architecture de porteur de copolymère de bloc les rend des candidats attrayants pour livrer des molécules thérapeutiques in vivo^{8,9,10,11,12,13}.

La livraison d’acides nucléiques thérapeutiques aux cibles cellulaires est un défi particulièrement important, et pour lequel les PCM offrent plusieurs avantages. Les acides nucléiques thérapeutiques (ADN génétique, ARNm et oligonucléotides tels que siRNA) ont un immense potentiel d’amélioration de la santé humaine, mais doivent surmonter de nombreux obstacles biologiques et physiques pour réaliser ce potentiel^14,15,16. Les acides nucléiques nus sont dégradés par le sérum et les nucléases cellulaires, sont rapidement éliminés de la circulation, et leur forte charge négative rend difficile pour eux de pénétrer les membranes cellulaires sans aide. Les approches actuelles pour surmonter ces obstacles comprennent des modifications chimiques coûteuses pour prévenir les dommages causés par les nucléases et/ou l’encapsulation dans diverses nanoparticules lipidiques assemblées par le biais d’interactions hydrophobes^15,17,18. Bien que ces méthodes se soient avérées efficaces pour les injections locales et le ciblage du foie, l’utilisation systémique présente des limites importantes de toxicité, d’immunogénicité et de biodistribution limitée¹⁶. En revanche, les PCM utilisent la charge négative des acides nucléiques pour les condenser dans le noyau phase-séparé, alors que la couronne neutre fournit une barrière stérique contre la dégradation aussi bien qu’une plate-forme pour incorporer des ligands pour améliorer le ciblage ou l’internalisation^11,19. Des études in vitro et animales ont montré que les PCM peuvent effectivement fournir diverses charges utiles d’acide nucléique^20,21,22,^23,24, mais les faiblesses dans notre capacité à prédire les propriétés PCM telles que la taille, la forme et la stabilité des propriétés des polymères constitutifs ont entravé leur adoption plus large.

Des travaux récents de notre groupe et d’autres dans le domaine ont commencé à résoudre ce problème en développant la structure-propriété, et dans certains cas structure-propriété-fonction des relations pour les PCM formés à partir d’acides nucléiques et divers polymères cationic-neutre^7,25,26,27. Deux thèmes cohérents qui ont émergé de ces études sont l’importance de développer des protocoles bien contrôlés et répétables pour l’assemblage de PCM et l’avantage d’utiliser de multiples techniques pour caractériser les nanoparticules résultantes. Les polyélectrolytes, en particulier ceux qui ont une forte densité de charge comme les acides nucléiques, interagissent très fortement les uns avec les autres et semblent facilement se coincer de façon kinétique lors du mélange, ce qui entraîne des préparations PCM très sensibles aux petites variations de procédure et présentent une polydispersity élevée et une faible répétabilité d’un lot à l’autre. Il a également été démontré que les PCM adoptent un large éventail de formes et de tailles en fonction des configurations au niveau atomique de leurs composants, et il est très difficile de capturer cette diversité avec n’importe quelle technique de caractérisation individuelle, d’autant plus que certaines techniques courantes telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS) nécessitent des hypothèses sur la forme des particules pour leur interprétation.

Dans cet article, nous discutons la conception et la sélection de matériel pour des PCM, avec un accent sur des oligonucléotides et des copolymères cationic-neutres de diblock. Nous décrivons alors un protocole d’annealing de sel qui emploie des concentrations élevées de sel suivies de la dialyse lente pour éviter le piégeage cinétique pendant l’assemblage de PCM. Les polyélectrolytes sont mélangés dans des conditions de sel élevé où les attractions électrostatiques sont filtrées, puis la concentration de sel est lentement abaissée pour permettre aux polyélectrolytes de s’installer dans leurs configurations les plus favorables énergétiquement, analogues au processus de refroidissement lent de l’annealing thermique. En utilisant ce protocole, nous sommes régulièrement en mesure d’atteindre une polydispersity exceptionnellement faible et une grande répétabilité pour les PCM oligonucléotides^7,26. Enfin, nous décrivons comment quatre techniques de mesure distinctes peuvent être utilisées pour caractériser les PCM sur une très large gamme d’échelles de longueur, de la morphologie externe à la structure interne : DLS, diffusion de lumière multi-angle (MALS), diffusion à rayons X à petit angle (SAXS) et microscopie électronique de transmission (TEM). Nous espérons que ces protocoles permettront à un plus grand nombre de chercheurs d’explorer efficacement les capacités de ces nanoparticules intéressantes.

Sélection et préparation des polymères
Les propriétés PCM sont fortement influencées par les caractéristiques physiques et chimiques des polymères constitutifs, ce qui fait de la sélection des polymères une étape critique dans le processus de conception. Les copolymères de bloc les plus bien caractérisés pour les PCM d’acide nucléique sont des diblocs linéaires tels que poly(lysine)-poly (éthylène glycol) (pLys-PEG), mais les PCM peuvent être formés entre les polyélectrolytes et une variété de polymères hydrophiles à charge neutre, qui peuvent être générés d’une manière de débit élevé²⁸. Le choix du groupe chargé affecte fortement la stabilité de l’appariement ionique et la forme des micelles²⁶, et la taille pcM a été montré pour augmenter avec la longueur du bloc chargé^5,7,26 (Figure 2), permettant ainsi aux propriétés PCM d’être réglés pour les exigences d’une application désirée. Pour les diblocs linéaires, nous avons constaté que le bloc chargé devrait avoir au moins 10 charges et être fortement chargé au pH désiré. Les blocs chargés plus longs peuvent favoriser la formation de PCM avec des oligonucléotides tels que siRNA, qui sont difficiles à complexer avec des blocs plus courts²¹. Nous avons observé avec succès la formation de PCM avec des longueurs de bloc jusqu’à 200, et la littérature décrit des polymères plus longs. Plus de flexibilité est disponible dans le choix des blocs neutres²⁴, mais l’expérience a montré que les blocs neutres très courts conduisent à l’agrégation plutôt que la formation de nanoparticules, et que la longueur neutre minimale augmente avec la longueur du bloc chargé. Pour les pLys-PEG, un MW PEG d’au moins 3 000 à 5 000 est nécessaire pour les longueurs de pLys inférieures à 50 euros, et des longueurs plus longues sont nécessaires à mesure que le bloc chargé est augmenté davantage. L’augmentation de la longueur du bloc neutre entraîne une augmentation de la taille du PCM, en particulier l’épaisseur de la coquille, en raison de l’encombrement stérique des polymères neutres.

Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation des PCM à partir de pLys-PEG lyophilisés de haute pureté et d’oligonucléotides de quantité connue, mais devrait être facilement adaptable à d’autres systèmes aussi bien. Nous l’avons testé avec succès avec plusieurs polypeptides chargés, y compris la polyarginine et l’acide polyglutamique, aussi bien que plusieurs polyélectrolytes synthétiques, tels que l’acide polyacrylique et le poly (vinylbenzyl trimethylammonium). Nous décrivons également la préparation de PCMs avec un rapport stoichiometric des charges de polyélectrolyte, mais ceci est facilement modifié. Nous trouvons qu’il est plus facile de travailler en unités de concentration de charge (c.c.), qui accueille aussi naturellement les polymères qui ne sont pas entièrement chargés. Si l’un ou l’autre polymère n’est pas bien caractérisé, il faut veiller à déterminer avec précision les longueurs/masses des polymères et à s’assurer que l’excès de sel n’est pas présent au-delà de celui nécessaire à la neutralisation des charges par dialyse, par exemple. La présence d’eau retenue doit également être prise en compte lors du calcul des concentrations. La concentration d’acide nucléique peut être commodément quantifiée par absorption à 260 nm, et la présence ou l’absence de phosphates terminaux devrait être prise en considération lors du calcul du c.c.

Lors de l’utilisation des oligonucléotides comme polyanions, l’état d’hybridation et la structure chimique aident à déterminer la propension à l’auto-assemblage et les caractéristiques du^PCM5^,7,26. L’optimisation de ceux-ci, dans les conditions pour l’efficacité biologique si l’utilisation des PCM pour l’administration, augmentera la probabilité de former les structures désirées. Les outils utiles pour analyser l’hybridation incluent les fonctions MATLAB pour les acides nucléiques, NUPACK²⁹, et IDT OligoAnalyzer. Nous recommandons d’analyser une séquence de candidat pour comprendre la force de la liaison à 1) elle-même dans une formation d’épingle à cheveux ; 2) une autre copie de la même séquence (auto-dimer); et 3) à d’autres oligonucléotides présents dans le système. Les températures de fusion de l’ADN et de l’ARN pour une séquence spécifique peuvent également être calculées à l’aide de la méthode voisine la plus proche^30,31. L’annexion thermique des acides nucléiques (étape 2.3) dénature toute structure secondaire résiduelle dans les nucléotides individuels et favorise le pliage de l’équilibre.

Caractérisation et analyse PCM
Un large éventail de techniques sont disponibles pour caractériser les nanoparticules, y compris la diffusion de la lumière statique et dynamique, la diffusion à petit angle d’électrons ou de neutrons, et la microscopie électronique. Dans cet article, nous fournissons des protocoles pour deux techniques de diffusion de lumière, la diffusion à petit angle de rayon X, et deux techniques de microscopie électronique.

DLS mesure l’autocorrélation des fluctuations temporelles dans l’intensité de diffusion à un angle du mouvement Brownien de l’échantillon. L’ajustement de ces données peut fournir un rayon hydrodynamique et une polydispersité pour les micelles sphériques (figure 3). La diffusion de la lumière à angle multiple (MALS) mesure l’intensité de diffusion statique à de nombreux angles. Cette dépendance angulaire décrit la forme de la nanoparticule, mais se limite à des échelles de longueur de plus de 50 nm pour la lumière visible, ce qui limite son efficacité pour les nanoparticules plus petites. Les deux techniques sont basées sur l’inadéquation de l’indice de réfraction et décrivent principalement les dimensions extérieures de la nanoparticule.

La diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) utilise les rayons X comme sonde de diffusion, et leur longueur d’onde plus courte permet des mesures sur une plage de 0,1 à 100 nm. L’ajustement de l’intensité de diffusion observée par rapport à l’angle (traditionnellement exprimé comme transfert d’élan q) fournit des informations sur la morphologie PCM (c.-à-d., la taille et la forme) et aussi la structure interne. Si un étalonnage d’intensité absolue est disponible, et si l’intensité de diffusion peut être extrapolée à l’angle zéro, la masse pcM et le nombre d’agrégation peuvent également être estimés³², ce qui rend SAXS une méthode extrêmement polyvalente et précieuse. La diffusion de neutrons à petit angle (SANS) est sensible sur une gamme similaire d’échelles de longueur, mais n’est disponible que dans des installations spécialisées et ne sera pas explicitement discutée dans cet article^33,34,35.

Ces dernières années ont vu l’avènement des instruments SAXS sur le banc, mais nous constatons que les sources de synchrotron sont mieux adaptées à la caractérisation pcM, car leur intensité plus élevée permet de recueillir des données beaucoup plus rapidement pour ces échantillons à faible contraste. Nous fournissons un bref protocole pour l’acquisition des données PCM SAXS à Beamline 12-ID-B à l’Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) du point de vue de l’utilisateur. Ce protocole devrait s’appliquer à la plupart des sources de synchrotron, mais il est fortement recommandé de consulter le personnel local avant de proposer une expérience. Nous fournissons également un protocole de réduction et d’analyse des données à l’aide d’Irena³⁶, un ensemble gratuit de macros écrite pour Igor Pro. Irena comprend un ensemble polyvalent de facteurs de forme pour la modélisation des données SAXS et permet la construction de modèles multicomposants capables de décrire le profil de diffusion complexe des PCM (voir Résultats représentatifs, Figure 4). Irena dispose également d’une documentation complète et de tutoriels disponibles en ligne. Avant de tenter les procédures ci-dessous, nous recommandons la familiarisation avec ceux-ci, en particulier le tutoriel “Modélisation des données SAXS avec deux populations principales de diffuseur”.

Les dommages causés par les radiations sont préoccupants pour la diffusion des rayons X, mais plusieurs mesures peuvent être utilisées pour la minimiser. En particulier, nous recommandons d’utiliser une configuration de cellule d’écoulement avec une pompe à seringues et un échantillon de PCM qui coule pendant l’acquisition de données, plutôt qu’un capillaire scellé. Cela simplifie également considérablement la soustraction de fond. Nous suggérons également de prendre plusieurs expositions de l’échantillon qui coule plutôt qu’une plus longue afin de limiter le flux que tout volume d’échantillon voit et de permettre la comparaison des données d’exposition pour identifier tout dommage.

Contrairement aux techniques de diffusion, qui nécessitent généralement un ajustement pour interpréter, la microscopie électronique de transmission (TEM) fournit une image visuelle réelle de l’espace des nanoparticules en passant un faisceau d’électrons à travers l’échantillon et en projetant une image sur un écran de scintillation (Figure 5). Nous présentons des protocoles pour deux techniques de TEM dans cet article. Cryo TEM congele des échantillons de micelle dans une fine couche de glace vitrée, préservant la conformation structurelle avec un minimum de substances étrangères, optimale pour les micelles de 10 à 100 nm dans un rayon. Tache négative TEM utilise un sel de métal lourd (p. ex. uranium) pour entourer l’échantillon après qu’il a été séché à la surface d’une grille. La tache dense dispersera plus d’électrons que l’échantillon, ajoutant du contraste et produisant une image négative de l’échantillon. Cryo TEM est recommandé pour les images de haute qualité. Cependant, il est plus coûteux, long, et peut ne pas fournir un contraste suffisant. Lorsqu’il s’agit d’une préoccupation, des échantillons tachés négatifs doivent être utilisés. Des exemples de chacun sont présentés à la figure 5.

Chacune de ces techniques rend compte d’aspects légèrement différents des nanoparticules, avec des forces et des limitations différentes. La diffusion de la lumière est facilement disponible, et est souvent l’approche la plus rapide, mais a des limites substantielles dans la taille et la résolution de la forme. SAXS peut fournir des informations sur une large gamme d’échelles de longueur à un débit raisonnablement élevé, mais nécessite de l’équipement spécialisé pour acquérir les données, ainsi que la modélisation pour les interpréter. Les images TEM sont simples à interpréter, mais peuvent être limitées en contraste et sont intrinsèquement faibles débit. Notre expérience a montré que l’utilisation de multiples techniques de caractérisation augmente considérablement l’information qui peut être obtenue sur les propriétés PCM et simplifie l’interprétation des ensembles de données obtenus de chacun seul. Par exemple, SAXS et TEM examinent principalement le noyau dense d’un PCM, tandis que la diffusion de la lumière rend compte des dimensions globales de la nanoparticule. Ainsi, les combiner permet de mesurer à la fois la taille du noyau et de la couronne. La capacité de TEM d’acquérir des images spatiales réelles peut fournir des données de vérité au sol pour permettre la sélection de facteurs de forme appropriés pour la modélisation des données SAXS qui pourraient autrement être ambigus. Cet article décrit les protocoles pour les quatre techniques, et un processus d’exemple pour les utiliser pour caractériser un échantillon inconnu est donné dans la section Discussion.