بسيطة خالية من الطباعة الحجرية خلية واحدة Micropatterning باستخدام الليزر قطع الإستنسل
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة micropatterning خالية من الطباعة الحجرية بسيطة ومتاحة لأولئك الذين يتمتعون بخلفية محدودة في الهندسة الحيوية. تستخدم هذه الطريقة الإستنسل اتّقص بالليزر حسب الطلب لبروتينات مصفوفة خارج الخلية في شكل اهتمام بتحوير الخلايا المورفولوجيا. يتم إثبات إجراء micropatterning باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من خلايا القلب.
Abstract
وقد استخدمت تقنيات micropatterning على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا لدراسة آثار السيطرة على شكل الخلية وحجمها على تحديد مصير الخلية في قرار الخلية الواحدة. تتضمن تقنيات الأنماط الدقيقة الحالية للخلية الواحدة الطباعة الحجرية اللينة والطباعة على التلامس الدقيق ، وهي تقنية قوية ، ولكنها تتطلب مهارات هندسية مدربة ودعم مرافق معينة في التصنيع الدقيق. وتتطلب هذه القيود تقنية أيسر منالا. هنا، نحن نصف طريقة بديلة بسيطة خالية من الطباعة الحجرية: الأنماط خلية واحدة على أساس الاستنسل. نحن نقدم إجراءات خطوة بخطوة بما في ذلك تصميم الاستنسل، وتصنيع الهيدروجيل البولياكريلاميد، ودمج البروتين القائم على الاستنسل، وطلاء الخلايا والثقافة. يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لنمط صفيف يصل إلى 2000 خلية. نحن نظهر نقش خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPSC) مع أشكال خلايا متميزة ، من 1:1 مربع إلى مستطيل يشبه القلب والقلب البالغ 7:1. هذا النقش خلية واحدة الاستنسل القائم هو خالية من الطباعة الحجرية، قوية من الناحية الفنية، مريحة، غير مكلفة، والأهم من ذلك في متناول أولئك الذين يعانون من خلفية الهندسة الحيوية محدودة.
Introduction
وقد أدى ظهور hiPSCs وما يتبع ذلك من تطوير بروتوكولات للتمايز الموجه إلى أنواع مختلفة من الخلايا إلى جعل من الممكن دراسة التنمية والمرض على مستوى جزيئي وخاص بالمريض ، على وجه التحديد باستخدام خلايا القلب iPSC المشتقة من المريض (iPSC-CMs) لنموذج cardiomyopathies1،2. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على دراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء باستخدام نظام iPSC ونماذج أخرى في المختبر هو عدم وجود بيئة صغيرة منظمة. في الموقع ، تخضع الخلايا لقيود المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وكذلك الخلايا المجاورة. التركيب الكيميائي الحيوي الخاص وصلابة هذه البيئات الدقيقة تملي التوزيع المكاني للخلايا وكذلك العوامل المتاحة للانخراط في التصاق الخلايا. وهذا بدوره يؤثر على مسارات الإشارات داخل الخلايا، والتعبير الجيني، وتحديد مصير الخلايا. على سبيل المثال، iPSC-CM ذات الأنماط الدقيقة في شكل قضيب يشبه البالغين لديه قدرة انكماش أفضل بكثير، وتدفق الكالسيوم، وتنظيم الميتوكوندريا، والفيزيولوجيا الكهربائية، وتشكيل أنبوب عرضي3. وبالتالي ، فإن خصائص البيئة الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من تنظيم الوظائف الخلوية.
تقنيات micropatterning السابقة تعتمد اعتمادا كبيرا على الطباعة الضوئية(الشكل 1A). في هذه التقنية ، يتم نسج طبقة من البوليمر الحساس للضوء ، أو مقاومة للضوء ، على ركيزة مسطحة من الحل لتشكيل فيلم رقيق يبلغ سمكه حوالي 1 ميكرومتر. بعد ذلك ، يتم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) على مقاومة الصور من خلال قناع يحتوي على النمط المطلوب. التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ضوء يغير كيميائيا مقاومة للضوء عن طريق تعديل ذوبانها في حل المطور الخاص بها، ونقل النمط المطلوب من القناع على الركيزة. تتضمن العديد من أساليب الأنماط الدقيقة الطباعة الضوئية ، لأنها تمنح النانومتر للتحكم على مستوى الميكرومتر في تصميم أنماط الخلية. ومع ذلك ، فإن الغزل من مقاومة الصور حساسة للغاية للشوائب ، لأن أصغر جزيئات الغبار سوف تعطل انتشار الحل في فيلم رقيقة. ولذلك يجب إجراء التصوير الضوئي في مرافق غير ملوثة، وهي مرافق مكلفة للصيانة وتتطلب خبرة خاصة للاستفادة منها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المواد الكيميائية المستخدمة في التصوير الضوئي غالبا ما تكون سامة للخلايا ويمكن أن تشوه الجزيئات الحيوية الهامة. وبالتالي، فإن الطباعة الضوئية تشكل عقبات كبيرة أمام تصنيع الأنماط الدقيقة للتطبيقات البيولوجية المريحة.
في عام 1994، تغلب وايتسايدس وزملاؤهاما 4 على بعض التحديات المرتبطة بالطباعة الضوئية من خلال ريادة مجموعة من التقنيات تسمى الطباعة الحجرية الناعمة. في الطباعة الحجرية الناعمة ، يتم استخدام سطح صغير الحجم مصنوع من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، وهو مادة شفافة تشبه المطاط ، لتوليد نمط من بروتينات ECM4. وتشمل التقنيات الطباعة الحجرية الناعمة الشائعة طباعة الاتصال الدقيق والنقش الميكرووتوني. في الطباعة microcontact، حاليا الطريقة الحجرية الناعمة الأكثر شعبية، ختم PDMS المغلفة مع بروتينات ECM ينقل المواد على سطح في المناطق التي اتصل بها الطابع(الشكل 1B). في الأنماط الدقيقة، تم تصميم الهياكل الدقيقة على سطح PDMS بحيث عندما يتم الضغط على الطابع إلى الركيزة، يتم إنشاء شبكة من القنوات الدقيقة، التي يمكن من خلالها تسليم السوائل إلى المناطق المطلوبة،(الشكل 1C)5. يوفر الطباعة الحجرية الناعمة العديد من الفوائد على الطباعة الضوئية. بمجرد أن يتم تصنيع رقاقة رئيسية ، يمكن بسهولة تكرار طوابع PDMS دون مزيد من التوظيف لمرافق الغرف النظيفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود مذيبات عضوية في عملية الطباعة الحجرية الناعمة يسمح باستخدام المواد البوليمرية مثل البوليسترين ، التي تستخدم عادة في زراعة الخلايا. وأخيراً، لا يقتصر النقش المجهري باستخدام أساليب الطباعة الحجرية الناعمة على الأسطح المسطحة. وبالتالي ، يزيد الطباعة الحجرية الناعمة من إمكانية الوصول إلى تصنيع النماذج الدقيقة ووظائفها على الطباعة الضوئية6. ومع ذلك، الطباعة الحجرية الناعمة لها عيوب كبيرة. على سبيل المثال، لا تزال هناك حاجة إلى خطوة النقش الأولية، باستخدام الطباعة الضوئية، لتلفيق الطابع. بالإضافة إلى ذلك ، يخضع النقش المجهري باستخدام طابع PDMS لاختلافات في جودة نقل البروتين إلى الركيزة6. تجنب هذه التناقضات يتطلب التحسين والاتساق في الضغط المطبق على ختم PDMS أثناء نقل البروتين ، وإلا يمكن أن يحدث تشوه وتشويه أحجام الميزات لقوالب PDMS6. هناك أيضا قلق كبير من استخدام PDMS بشكل متكرر بسبب امتصاص جزيء صغير7.
لتجنب استخدام الطباعة الضوئية الناعمة وطوابع PDMS ، نصف طريقة micropatterning خلية واحدة قائمة على الاستنسل ، خالية من الطباعة الحجرية التي تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الضوئية والطباعة الحجرية اللينة. في هذه الطريقة، يتم استخدام هيدروجيل البولياكريلاميد كركيزة لدمج بروتين ECM القائم على الاستنسل، مما يسمح بالطلاء الانتقائي لـ hiPSC-CMs واحد. هذه التقنية متوافقة للغاية مع المواد البوليمرية المستخدمة في ظروف ثقافة الخلايا الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، مع التنظيف السليم والصيانة، والاستنسل قابلة لإعادة استخدام ومقاومة للتدهور وامتصاص البروتين أثناء عملية التصنيع المجهري. وأخيراً، فإن عملية الأنماط قوية تقنياً وغير مكلفة وقابلة للتخصيص ومتاحة لأولئك الذين ليس لديهم مهارات متخصصة في الهندسة الحيوية. وقد استخدمت هذه التقنية المجهرية الاستنسل القائم على نطاق واسع في منشوراتنا الأخيرة نمذجة أمراض القلب المتنوعة8،9،10.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف طريقة النقش المجهري المستندة إلى الاستنسل الخالية من الطباعة الحجرية التي تمكن من الأنماط الفعالة للخلايا الملتصقة. في هذا البروتوكول، ونحن نظهر النقش من hiPSC-CMs في نسب مختلفة طول إلى العرض عن طريق micropatterning الطابق السفلي غشاء مصفوفة جزر البروتين على هيدروجيلات البولياكريلاميد مع ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد ستانفورد لأبحاث صحة الطفل (CHRI) والمعهد الوطني للصحة (1F32HL142205-01) إلى S.L، جائزة رائد مكتب المعاهد القومية للصحة (LM012179-03)، وجمعية القلب الأمريكية جائزة المحقق (17EIA33410923)، ومعهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية، ومؤسسة هوفمان وشروبفر، وقسم ستانفورد لطب القلب والأوعية الدموية، قسم الطب إلى S.M.W ، جوائز من المعهد الوطني للصحة (UG3 TR002588، P01 HL141084، R01 HL126527، R01 HL113006، R01 HL123968) وبرنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ (TRDRP 27IR-0012) إلى J.C.W، وجمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه (18POST34030106) إلى H.Y، وزمالة هنغستبرجر إلى T.S. نشكر الدكتور أندرو أولسن من خدمة الفحص المجهري لعلم الأعصاب في ستانفورد على دعم التصوير البؤري لـ hiPSC-CM المنقوشة بالميكروها. نشكر H.Y. لتصميم الاستنسل الأول، والتصنيع، وmicropatterning خلية واحدة من iPSC-CM على polyacrylamide هيدروجيل المغلفة coverslip، والتصوير الأولي confocal من بنية ساركومير من خلية واحدة micropatterned iPSC-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
