המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס ממלא תפקיד מרכזי בעיבוד תגמול ולמידה חיזוק. הבנת האופן שבו התשומות העצביות המגוונות לתוך שחרור DA פאזי של בקרת VTA יכולה לספק תמונה טובה יותר של המעגלים השולטים בעיבוד תגמול ולמידת חיזוק. כאן, אנו מתארים שיטה המשלבת חליטות צינוריות פנים-VTA של אגוניסטים ואנטגוניסטים רוקח עם שחרור DA פאזי מעורר גירוי (עירוי וגירוי משולב, או CIS) כפי שנמדד על ידי voltammetry מחזורי סריקה מהירה (FSCV). באמצעות CIS-FSCV בחולדות מרדים, תגובת DAphasic יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי VTA עם אלקטרודה דו קוטבית מצוידת צינורית תוך הקלטה בליבת גרעין האקומבנס. אגוניסטים רוקח או אנטגוניסטים ניתן להחדיר ישירות באתר הגירוי כדי לחקור תפקידים ספציפיים של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic. היתרון העיקרי של CIS-FSCV הוא כי תפקוד קולטן VTA ניתן ללמוד ב vivo, בניית מחקרים במבחנה.
שחרור דופמין פאסיק (DA) מהאזור הטגמנטלי הגחוני (VTA) לגרעין האקומבנס (NAc) ממלא תפקיד חיוני בהתנהגויות הקשורות לתגמול. נוירונים VTA DA לעבור מירי דמוי טוניק (3-8 הרץ) לירי דמוי פרץ (>14 הרץ)1, אשר מייצר שחרור DA פאזי ב- NAc. VTA מבטא מגוון של קולטנים סומטונדריטיים הממוקמים היטב כדי לשלוט על המתג מטוניק לפרץירי 2,3,4,5. זיהוי אילו קולטנים אלה, והתשומות המתאימות להם, שחרור DA פאזי שליטה יעמיקו את הבנתנו כיצד מאורגנים המעגלים הקשורים לתגמול. מטרת המתודולוגיה המתוארת כאן, עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV), היא להעריך במהירות ובחזקה את הפונקציונליות של קולטני VTA בנהיגה שחרור DAphasic.
המונח עירוי וגירוי משולבים (CIS) מתייחס קולטנים מניפולציה פרמקולוגית על קבוצה של נוירונים (כאן VTA) וממריץ נוירונים אלה ללמוד את תפקוד הקולטן. בחולדה המרדים, אנו מעוררים חשמלית את ה- VTA לעורר אות DA פאזי גדול (1-2 מיקרומטר) בליבת NAc, כפי שנמדד על ידי וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (FSCV). חליטות של תרופות פרמקולוגיות (כלומר, אגוניסטים קולטן/אנטגוניסטים) באתר הגירוי ניתן להשתמש כדי למדוד את הפונקציה של קולטני VTA על ידי התבוננות בשינוי הבא בשחרור DA פאזי מעורר. FSCV היא גישה אלקטרוכימית הנהנית הן מרחבית גבוהה (50-100 מיקרומטר) והן רזולוציה זמנית (10 הרץ), ומתאימה היטב למדוד אירועי DA פאזיים הקשורים לתגמול6,7. רזולוציה זו עדינה יותר ממדידות נוירוכימיות אחרות של vivo, כגון מיקרודיאליזה. לכן, יחד, CIS-FSCV מתאים היטב כדי להעריך ויסות קולטן VTA של שחרור דופמין פאזי.
דרך נפוצה אחת לחקור את תפקוד קולטן VTA היא באמצעות שילוב של גישות אלקטרופיזיולוגיות המטפלות באופן שבו קולטנים אלה משנים את קצב הירי של נוירונים1,8. מחקרים אלה הם בעלי ערך רב בהבנת מה קולטנים מעורבים בהנעת DA ירי בעת ההפעלה. עם זאת, מחקרים אלה יכולים רק להציע מה עלול לקרות במורד הזרם במסוף אקסון (כלומר, שחרור של נוירוטרנסמיטר). CIS-FSCV בונה על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה על ידי מענה כיצד הפלט של VTA פרץ ירי, שחרור DA פאזי, מוסדר על ידי קולטנים הממוקמים על דנדריטים VTA וגופי תאים. לכן, CIS-FSCV מתאים היטב לבנות על מחקרים אלקטרופיזיולוגיים אלה. כדוגמה, הפעלת קולטן nicotinic יכול לגרום יריפרץב VTA 9 , ו CIS-FSCV בחולדה מרדים שימש כדי להראות כי קולטן אצטילכולין nicotinic (nAChR) הפעלת VTA גם שולט שחרור DA פאזי ב NAc10,11.
בדיקה מכנית של רגולציה DAphasic נלמד גם בדרך כלל באמצעות תכשירי פרוסה יחד עם יישום אמבטיה של תרופות. מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות ברגולציה presynaptic של שחרור DAphasic מסופי דופמין, כמו גופי התא מוסרים לעתים קרובות מן הפרוסה12. תכשירים אלה הם בעלי ערך לחקר השפעות קולטן presynaptic על מסופי דופמין, בעוד CIS-FSCV מתאים יותר ללמוד השפעות קולטן סומטונדריטי על נוירונים דופמין, כמו גם תשומות presynaptic ל- VTA. הבחנה זו חשובה, כי הפעלת קולטן somatodendritic ב- VTA עשוי להיות השפעה שונה מאשר הפעלת קולטן פרסינפטי NAc. ואכן, חסימת דופאמין presynaptic nAChRs ב NAc יכול להעלות את שחרור דופמין פאזי במהלך פרץ ירי13, ואילו ההפך נכון VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV היא גישה אידיאלית לחקר היכולת של קולטני VTA לווסת את שחרור DA פאזי. חשוב לציין, גישה זו יכולה להתבצע בחולדה שלמה, או מרדים או לנוע חופשי. גישה זו מתאימה למחקרים חריפים, כדי לחקור את תפקוד הקולטן במצב הבסיסי שלה10,14, כמו גם מחקרים ארוכי טווח שיכולים להעריך שינויים תפקודיים קולטן לאחר חשיפה לסמים או מניפולציה התנהגותית11,15.
CIS-FSCV מספק הזדמנות ייחודית לחקור מנגנוני קולטן VTA שבבסיס שחרור DA פאזי. ישנם שני שלבים קריטיים על מנת להבטיח הקלטה נכונה. ראשית, יש להשיג הקלטה בסיסית יציבה, עם מעט סחיפה באות DA המעורר. דרך חשובה להגדיל את הסבירות להקמת הקלטה יציבה היא להבטיח כי האלקטרודה היה מספיק זמן מחזור הן 60 הרץ ו 10 הרץ (בד…
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכה על ידי מכללת אליזבתטאון (R.J.W, M.L., ו- L.M.), על ידי מלגת בוגרי NSF (R.J.W. ) ועל ידי בית הספר לרפואה של ייל (N.A.).
Electrode Filling Solution/Supplies | |||
Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
Electrode Supplies | |||
Carbon fiber | Thornel | T650 | |
Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
FSCV Hardware/Software | |||
Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
Stimulator Hardware | |||
Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
Infusion/Stimulation Supplies | |||
Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
Surgical Supplies | |||
Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
Histological Supplies | |||
Formulin | Sigma | 1004960700 | |
Power supply | BK Precision | 9110 | |
Sucrose | Sigma | 80497 | |
Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
Drugs for infusions | |||
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |