Infusione e stimolazione combinate con voltammetria ciclica a scansione rapida (CIS-FSCV) per valutare la regolazione del recettore dell'area tegmentale ventrale della dopamina fasica
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quello di manipolare direttamente i recettori dell’area tegmentale ventrale per studiare il loro contributo al rilascio di dopamina al di sottosecondo.
Abstract
Il rilascio di dopamina fasica (DA) dall’area tegmentale ventrale (VTA) al nucleo accumbens svolge un ruolo fondamentale nell’elaborazione della ricompensa e nell’apprendimento per rinforzo. Comprendere come i diversi input neuronali nel rilascio di DA fasico di controllo VTA può fornire un quadro migliore dei circuiti che controllano l’elaborazione della ricompensa e l’apprendimento per rinforzo. Qui, descriviamo un metodo che combina infusioni di cannule intra-VTA di agonisti e antagonisti farmacologici con rilascio di DA fasico evocato dalla stimolazione (infusione e stimolazione combinate, o CIS) misurato mediante voltammetria ciclica a scansione rapida in vivo (FSCV). Utilizzando CIS-FSCV in ratti anestetizzati, una risposta DA fasica può essere evocata stimolando elettricamente il VTA con un elettrodo bipolare dotato di una cannula durante la registrazione nel nucleo accumbens. Gli agonisti o gli antagonisti farmacologici possono essere infusi direttamente nel sito di stimolazione per studiare i ruoli specifici dei recettori VTA nel guidare il rilascio di DA fasico. Uno dei principali vantaggi di CIS-FSCV è che la funzione del recettore VTA può essere studiata in vivo, basandosi su studi in vitro.
Introduction
Il rilascio di dopamina fasica (DA) dall’area tegmentale ventrale (VTA) al nucleo accumbens (NAc) svolge un ruolo vitale nei comportamenti legati alla ricompensa. I neuroni VTA DA passano da un fuoco tonico (3-8 Hz) a un fuoco a raffica (>14 Hz)1, che produce il rilascio di DA fasico nel NAc. Il VTA esprime una varietà di recettori somatodendritici che sono ben posizionati per controllare il passaggio da tonico a scoppio2,3,4,5. Identificare quali di questi recettori e i loro rispettivi input controllano il rilascio di DA fasico approfondirà la nostra comprensione di come è organizzato il circuito correlato alla ricompensa. Lo scopo della metodologia qui descritta, combinata di infusione e stimolazione con voltammetria ciclica a scansione rapida (CIS-FSCV), è quello di valutare rapidamente e in modo robusto la funzionalità dei recettori VTA nel guidare il rilascio di DA fasico.
Il termine infusione e stimolazione combinata (CIS) si riferisce alla manipolazione farmacologica dei recettori su un gruppo di neuroni (qui il VTA) e alla stimolazione di quei neuroni a studiare la funzione del recettore. Nel ratto anestetizzato, stimoliamo elettricamente il VTA per evocare un grande segnale DA fasico (1-2 μM) nel nucleo NAc, misurato mediante voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV). Infusioni di farmaci farmacologici (cioè agonisti/antagonisti del recettore) nel sito di stimolazione possono essere utilizzate per misurare la funzione dei recettori VTA osservando il successivo cambiamento nel rilascio di DA fasico evocato. FSCV è un approccio elettrochimico che gode di un’elevata risoluzione spaziale (50-100 μm) e temporale (10 Hz) ed è adatto per misurare eventi DA fasici correlati alla ricompensa6,7. Questa risoluzione è più fine di altre misurazioni neurochimiche in vivo, come la microdialisi. Pertanto, insieme, CIS-FSCV è adatto per valutare la regolazione del recettore VTA del rilascio di dopamina fasica.
Un modo comune per studiare la funzione del recettore VTA è utilizzando una combinazione di approcci elettrofisiologici che affrontano il modo in cui tali recettori alterano la velocità di attivazione dei neuroni1,8. Questi studi sono molto preziosi per capire quali recettori sono coinvolti nel guidare l’attivazione di DA al momento dell’attivazione. Tuttavia, questi studi possono solo suggerire cosa potrebbe accadere a valle del terminale assonale (cioè il rilascio di un neurotrasmettitore). CIS-FSCV si basa su questi studi elettrofisiologici rispondendo a come l’output del rilascio di DA fasico del VTA è regolato dai recettori situati sui dendriti VTA e sui corpi cellulari. Pertanto, CIS-FSCV è adatto per costruire su questi studi di elettrofisiologia. Ad esempio, l’attivazione del recettore nicotinico può indurre scoppi nel VTA9e CIS-FSCV nel ratto anestetizzato è stato usato per dimostrare che l’attivazione del recettore nicotinico dell’acetilcolina (nAChR) nel VTA controlla anche il rilascio di DA fasico nel NAc10,11.
L’esame meccanicistico della regolazione da DA fasica è anche comunemente studiato utilizzando preparazioni a fette insieme all’applicazione del bagno di farmaci. Questi studi si concentrano spesso sulla regolazione presinaptica del rilascio di DA fasico dai terminali della dopamina, poiché i corpi cellulari vengono spesso rimossi dalla fetta12. Questi preparati sono preziosi per studiare gli effetti dei recettori presinaptici sui terminali della dopamina, mentre CIS-FSCV è più adatto per studiare gli effetti del recettore somatodendritico sui neuroni della dopamina, così come gli input presinaptici al VTA. Questa distinzione è importante, perché l’attivazione del recettore somatodendritico nel VTA può avere un effetto diverso rispetto all’attivazione del recettore presinaptico NAc. In effetti, il blocco dei nAChR presinaptici dopaminergici nel NAc può elevare il rilascio di dopamina fasica durante la raffica13, mentre il contrario è vero a VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV è un approccio ideale per studiare la capacità dei recettori VTA di regolare il rilascio di DA fasico. È importante sottolineare che questo approccio può essere eseguito in un ratto intatto, anestetizzato o in movimento libero. Questo approccio è adatto per studi acuti, per studiare la funzione del recettore nel suo stato basale10,14 e studi a lungo termine in grado di valutare i cambiamenti funzionali in un recettore dopo l’esposizione al farmaco o la manipolazione comportamentale11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV offre un’opportunità unica per studiare i meccanismi del recettore VTA alla base del rilascio di DA fasico. Ci sono due passaggi critici per garantire una corretta registrazione. In primo luogo, è necessario ottenere una registrazione di base stabile, con poca deriva nel segnale DA evocato. Un modo importante per aumentare la probabilità di stabilire una registrazione stabile è assicurarsi che l’elettrodo abbia avuto tutto il tempo di pedalare sia a 60 Hz che a 10 Hz (in genere 15 minuti a 60 Hz e 10 minuti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto dall’Elizabethtown College (R.J.W, M.L. e L.M.), da una NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) e dalla Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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