Microwaving e Fluorophore-Tyramide para Imunocoloração Multiplex em Adrenals de camundongos − Usando Anticorpos primários conjugados da mesma espécie hospedeira
Summary
Vários métodos diferentes foram estabelecidos para a imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Aqui, descrevemos o uso de anticorpos mediados por micro-ondas e de fluoroforre-tyramida para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos durante a imunocoloração multiplex em seções adrenal de camundongos forjadas fixadas em formalina.
Abstract
A imunocoloração é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas para mostrar o padrão de expressão celular de uma determinada proteína. A imunocoloração multiplex permite rotular usando múltiplos anticorpos primários. Para minimizar a reatividade cruzada de anticorpos, a imunocoloração multiplex usando manchas indiretas requer anticorpos primários não rotulados de diferentes espécies hospedeiras. No entanto, a combinação apropriada de diferentes anticorpos de espécies nem sempre está disponível. Aqui, descrevemos um método de uso de anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira (por exemplo, neste caso, ambos os anticorpos são de coelho) para imunofluorescência multiplex em seções adrenal de camundongos forfinados fixadas (FFPE). Este método utiliza o mesmo procedimento e reagentes utilizados na etapa de recuperação de antígenos para despir a atividade do complexo de anticorpos primários anteriormente manchado. Slides foram manchados com o primeiro anticorpo primário usando um protocolo geral de imunocoloração seguido de um passo de ligação com um anticorpo secundário biotinylado. Em seguida, um método de desenvolvimento de sinal avidin-biotina-peroxidase foi usado com fluorofide-tyramida como substrato. A imunoatividade do primeiro complexo primário de anticorpos foi despojada através da imersão em uma solução de citrato de sódio fervente micro-ondas por 8 min. O deposição fluorofídeo insolúvel permaneceu na amostra, o que permitiu que o slide fosse manchado com outros anticorpos primários. Embora este método elimine a maioria dos sinais positivos falsos, alguns antecedentes da reatividade cruzada de anticorpos podem permanecer. Se as amostras forem enriquecidas com biotina endógena, um anticorpo secundário conjugado por peroxidase pode ser usado para substituir o anticorpo secundário biotinylado para evitar o falso positivo da biotina endógena recuperada.
Introduction
Na imunocoloração multiplex, a coloração direta usando anticorpos primários conjugados pode fornecer resultados informativos. Sem o uso de anticorpos secundários, o método de coloração direta tem baixo risco de falsos sinais de colocalização da reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, os repórteres conjugados (fluorofóbico, enzimas) ou biotina no anticorpo primário limitam seu uso futuro. Alternativamente, a imunocoloração indireta geralmente fornece sinais mais fortes usando um anticorpo primário não conjugado com um anticorpo secundário rotulado. Idealmente, anticorpos primários não conjugados usados na imunocoloração multiplex devem vir de diferentes espécies hospedeiras para evitar a reatividade cruzada de anticorpos. No entanto, a combinação apropriada de anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras nem sempre está disponível.
Vários métodos foram estabelecidos para eliminar o risco do anticorpo secundário reagir com um anticorpo primário indesejado. Um método comum é o uso de um anticorpo monomérico F (ab) para bloquear quaisquer epítopos de ligação restantes no primeiro complexo primário de anticorpos antes de colorir com o segundo anticorpo primário1. A desmontagem de anticorpos, semelhante à tira e resonda de uma folha de manchas ocidentais, remove o complexo de anticorpos manchado anteriormente sem desmontar a deposição de moléculas de repórteres detectáveis, como 3,3′-diaminobenzidina tetracloridride (DAB)2 e a dposição de tyramida fluorescente3. Com este método, moléculas de repórteres em cores diferentes podem mostrar um resultado multiplex no mesmo slide. A coloração multiplex também é alcançável pela remoção completa das camadas anteriormente depositadas de anticorpos e o alinhamento de imagens posteriormente adquiridas de outros anticorpos4,5. Todos esses métodos dão resultados confiáveis, embora cada método tenha suas limitações e exija procedimentos complicados ou um sistema especial de imagem.
O protocolo atual mostra a aplicação de um método de desmontagem de anticorpos com o uso de buffers comumente disponíveis. Este protocolo pode ser usado para realizar manchas imunofluorescentes multiplex em seções adrenal de camundongos fixas de parafina fixas formalinadas (FFPE) com dois anticorpos primários não rotulados da mesma espécie hospedeira.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imunocoloração multiplex é útil para examinar a colocalização celular de dois ou mais antígenos. Esta técnica amplamente utilizada dá resultados convincentes de colocalização quando os anticorpos primários são conjugados com diferentes repórteres (coloração direta). No entanto, a coloração direta geralmente fornece sinais mais fracos em comparação com a coloração indireta, que envolve anticorpos secundários conjugados para detectar os anticorpos primários. Na coloração indireta, um resultado d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
