מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה
Summary
מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.
Abstract
כלמידיה trachomatis היא פתוגן מחייב-תאיים כי כבר קשה היסטורית כדי לתמרן גנטית. התקדמות מוחלטת בהסבר המנגנונים כי C. trachomatis להשתמש כדי ליצור ולתחזק נישה תאיים מיוחסת הוגבלה בשל חוסר כלים גנטיים. למרבה המזל, לאחרונה היו מספר פיתוחים חדשים בטכניקות מניפולציה גנטית. בין השאר מדובר בהתפתחות של מוטסיס allelic exchange שדווחו על ידי קרינה פלואורסצנטית (FRAEM). שיטה זו מאפשרת מחיקה גנטית ממוקדת יחד עם החדרת קלטת בחירה קידוד עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP). הסתמכות על אסטרטגיה זו יכולה להיות מסובכת בעת המיקוד גנים בתוך האופריונים polycistronic בשל הפוטנציאל של השפעות הקוטב על הגנים במטה. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM), הפרוטוקול אשר מתואר כאן, פותחה כדי להקל על אפקטי הקוטב של הקלטת. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת הבחירה לאחר ממוקד המחיקה על ידי allelic exchange. הזנים וכתוצאה מכך מכילים מחיקות גנים ללא מרסן של רצפי קידוד אחד או יותר. טכניקה זו מקלה על הערכה ישירה של פונקציית הגן ומרחיבה את הרפרטואר של כלים לטיפול גנטי ב- C. trachomatis.
Introduction
כלמידיה טרכוטיס היא הגורם המוביל למחלה מינית חיידקית ומהווה נטל משמעותי לבריאות האדם. מעל 100,000,000 אנשים נגועים בכל שנה עם C. trachomatis1. כ 70% של זיהומים בנשים הם אסימפטומטיים למרות השפעות בריאות הרבייה מזיקה, כגון מחלה דלקתית האגן, הריון חוץ רחמי, ו/או פוריות. סקוויה מחלה קשורים ישירות immunopathology ביוזמת C. trachomatis זיהום2. חיסון יעיל עדיין לא התפתח; לכן, הבנת הפונקציה של גורמים התקפה אלימה חיידקים ומוצרים אחרים גנים בקטריאליים היא שאלה חשובה ודחופה מחקר.
כמו חיידקים תאיים, הפלישה תא מארח, שכפול תאיים, שחרור של צאצאים, והתחמקות של תגובות אימונולוגיים מארח הם תהליכים קריטיים. ג. טראכוטיס יוצר קרום פרזיטוהורבי מאוגד, הנקרא הכללה, עבור פיתוח תאיים. הקמת הכללה ותהליכים קריטיים רבים אחרים מושגת על ידי הפרשת חלבונים של אפקטור דרך מערכת הפרשה מסוג III (T3SS)3. להבהיר את התפקודים של העריקים המופרשים הללו הוגבלה במשך שנים רבות בשל הצורך הגנטי של ה -trachomatis. בניגוד ל -E. coli, טכניקות שיבוט קלאסיות רבות אינן חלות על כלמידיה. מספר מגבלות גדולות כרוכות ביעילות שינוי, חוסר כתבים נגד כגון Sacb ותחזוקת פלביניים. בעוד E. coli החיידק יכול בדרך כלל להישמר ללא הגבלה עם מקור של שכפול והלחץ סלקטיבי המתאים, C. trachomatis פלמידים דורש שמונה נוספים מסגרות קריאה פתוחות (pgp1-8) עבור תחזוקה שנמצאו על הילידים pL2 פלמיד ב-L2 serovar4.
בשנים האחרונות היו כלים גנטיים מרובים שנוצרו המתאימים ביולוגיה ייחודית של כלמידיה , עדיין יש מגבלות עדיין5,6,7. מוטגנזה כימית על ידי הטיפול אתיל מתיונין (EMS) יכול להציג מוטציות missense, או (בתדירות נמוכה יותר) יכול לגרום מעברים נוקלאוטיד היכרות מוקדמת להפסיק קודון להניב מוטציה שטויות8. החדרת טרנספסון היא יעילה לשיבוש גנים, אך הטכנולוגיה הנוכחית של כלמידיה מחקר היא מפרך וגוזלת זמן9. הן שיטות הטיפול ב-EMS והן הטרנספסון מחוללים מוטציות אקראיות ודורשות שיטות סינון קפדניות לבידוד זנים מוטנטים. שיטה לשבש את הגנים על ידי החדרת introns קבוצה II (למשל, היעד) מאפשר מוטסיס מונחה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על-ידי יעילות, ואתר ההכנסה אינו צפוי תמיד10.
קרינה פלואורסצנטית דיווחו allelic exchange מוטגנזה (FRAEM) היא אסטרטגיה המשמשת עבור מחיקה גנטית ממוקדת בשילוב עם החדרת קלטת בחירה מתן עמידות לאנטיביוטיקה וכתבת פלואורסצנטית11. עם זאת, FRAEM הוא מסובך על ידי הפוטנציאל של השפעות הקוטב בקלטת המושרה על הגנים במורד הזרם, במיוחד כאשר מיקוד גנים בתוך האופרונים polycistronic. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM) היא גישה גנטית הרומן שפותחה כדי להקל על השפעות הקוטב המושרה קלטת בעבר נצפתה עם קלטת בחירת FRAEM12. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת בחירה ושחזור ביטוי של גנים במורד הזרם. הקלטת הבחירה המכילה עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP) מהונדסים מחדש עם האגף Loxp אתרים. אתרים אלה Loxp יכול לשלב מחדש בנוכחות של הrecombinase היצור והתוצאה של כריתה של הקלטת מן הגנום13. אסטרטגיה זו הוכח להקל על משפיע הקלטת אפקטים קוטביים כאשר מיקוד tmea עבור מחיקה12,14.
הן FRAEM ו-FLAEM שיטות לנצל את אותו וקטור התאבדות, pSUmC 4.0, אשר ניתן לשמור באופן מותנה דרך inducible ביטוי של pgp6. ביטוי של pgp6 יש בעבר הוכח להיות הכרחי עבור החזקת פלסטלינה, ולכן ממונפת כדי לשלוט בתחזוקה הפלמיד11,15. כאשר C. trachomatis גדל בתקשורת בתוספת טטרציקלין הידרלי (האווירית) כדי לגרום pgp6 ביטוי, וקטור נשמר. בהיעדר האווירית, הווקטור אובד. מחיקת גנים ממוקדת מושגת באמצעות allelic exchange של הגן עבור הקלטת בחירה. האזורים 3 kb ישירות במעלה ובמורד הזרם של הגן המיועד לשמש כזרועות הומולוגיה עבור שילוב מחדש. זרועות אלה משוכפלות לתוך pSUmC 4.0 וקטור מאגף את הקלטת הבחירה. מוצלח C. trachomatis ואירועים שילוב מחדש הם נצפו באמצעות דיווח פלואורסצנטית. ביטוי של שרי על השדרה הווקטורית ו gfp בתוך הקלטת בחירה להניב פלורסנט אדום וירוק הכללות. לאחר הסרת התקשורת האווירית הוסר מן המדיה התרבותית, ירוק בלבד הכללות לציין אירועים מוצלחים שילוב מוצלח עם אובדן וקטור ההתאבדות ואינטגרציה של הקלטת הבחירה לתוך הגנום חיידקי.
FLAEM מייצג הרחבה של FRAEM באמצעות שינוי הבאים של recombinase ביטוי וקטור, pSU-היצור, לתוך זן מוטציה חדש שנוצר. היצור recombinase מאפשר שילוב מחדש בין אתרי Loxp לבין כריתה של קלטת הבחירה. אירועים שילוב מחדש מצוינים באמצעות דיווח על קרינה פלואורסצנטית. מקודד וקטורי בטעםpsu; לפיכך, שינוי מוצלח מצוין על-ידי הוספת פלואורסצנטית אדום ל- gfp-הבעת הכללות. טיפוח בהעדר לחץ סלקטיבי לתוצאות הקלטת בשילוב מחדש באתרי Loxp , ואובדן הקלטת מצוין על ידי הכללות אדומות בלבד. כמו עם pSUmC-4.0, ביטוי inducible של pgp6 משמש לשמור מותנה psu-היצורים. ברגע שהאווירית והבחירה האנטיביוטיים מוסרים, הפלסמיד נרפא, והזן המתקבל של מחיקת המחיקה אינו פלורסנט. שיטה זו מטפלת בנושא של אפקטי הקוטב המושרה בקלטת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן עבור הדור של מחיקות גנים markerless ב- C. trachomatis ידי flaem מאפשרת מחיקה ממוקדת של גנים לא חיוניים ומבטלת המושרה קלטת אפקטי הקוטב. הפרוטוקול מסתמך על עיצוב קפדני של 5 ‘ ו 3 ‘ זרועות הומולוגיה שנוספו לתוך pSUmC 4.0 וקטור התאבדות, שינוי יעיל של C. trachomatis, והקרנה זהירה של זנים מוטנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שירות בריאות הציבור מן המכון הלאומי לבריאות, NIAID (מענקים A1065530 ו Al124649), כדי K.A. שדות.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
- World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, 207-208 (2012).
- Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
- Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
- Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
- Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
- Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
- Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
- LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
- Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
- Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
- Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
- Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
- McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
- Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
- Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
- Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
- Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).
