Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

De toepassing van massaspectrometrie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van het metabolisme. Gerichte metabole profilering en metabolomic tracing zorgen voor nauwkeurige monitoring van veranderingen in het energiemetabolisme. Echter, het uitvoeren van metabolomica met succes vereist uitgebreide training, ervaren personeel, en dure, zeer gevoelige massaspectrometers niet gemakkelijk beschikbaar voor elk laboratorium. In de afgelopen jaren is het gebruik van een extracellulaire flux analysator, zoals de Seahorse XFe96, populair geworden als een surrogaat methode voor het meten van veranderingen in het energiemetabolisme in verschillende celtypen^1,2,3,4,5.

Sperma zijn zeer gespecialiseerde beweeglijke cellen; waarvan de taak is om het vaderlijke genoom aan de eicel te leveren. Sperma dat het mannelijke voortplantingsstelsel na de ejaculatie verlaat, is nog steeds functioneel onrijp en kan de eicel niet bevruchten omdat ze niet in staat zijn om de vestments van de eicellen te penetreren. Sperma verwerven bemesting competentie als ze doorgeven door het vrouwelijke voortplantingskanaal in een rijpingsproces bekend als capacitatie^6,7. Vers ejaculeerd sperma of sperma uit de Cauda epididymis kan in vitro worden bekwaam door incubatie in gedefinieerde capacitatiemedia met CA^{2 +}, bicarbonaat (HCO₃^–) of een cel-permeabel kamp analoog (bijv. dibutyryl-Camp), een cholesterol acceptor (bv. Runderalbumine, BSA) en een energiebron (bijv. glucose). Tijdens de capaciteits wijziging wijzigt het sperma hun motiliteits patroon in een asymmetrische flagellar-beat, die een zwemmodus met de naam Hyper activatie^8,9vertegenwoordigt, en ze worden bekwaam om de acrosome-reactie⁷te ondergaan, waar Proteolytische enzymen vrijkomen die de vesteringen van de eicellen verteren. Deze processen vereisen energie, en vergelijkbaar met somatische cellen, sperma genereren ATP en andere hoge energieverbindingen via glycolyse, alsmede mitochondriale TCA-cyclus en oxidatieve fosforylering (oxphos)¹⁰. Terwijl meerdere studies aantonen dat glycolyse noodzakelijk en voldoende is voor de ondersteuning van sperma capaciteit^11,12,13,14, is de bijdrage van oxphos minder duidelijk. In tegenstelling tot andere celtypen waar glycolyse fysiek gekoppeld is aan de TCA-cyclus, worden sperma sterk gecompartialiseerd en wordt gedacht dat het deze processen in aparte flagellar-compartimenten handhaaft: het middenstuk concentreert de mitochondriale machines, terwijl de belangrijkste enzymen van glycolyse lijken te worden beperkt tot het hoofdstuk^15,16. Deze compartimenging leidt tot een voortdurende discussie over de vraag of pyruvaat geproduceerd in het hoofdstuk door glycolyse mitochondriale oxphos in het middenstuk kan ondersteunen, en of ATP geproduceerd door oxphos in het middenstuk zou kunnen diffuus voldoende snel over de lengte van het flagellum ter ondersteuning van de energie-eisen in distale delen van het hoofdstuk^17,18,19. Er is ook ondersteuning van een rol voor oxphos in sperma-capacitatie. Niet alleen is oxphos meer energetisch gunstiger dan glycolyse, het genereren van 16 keer meer ATP dan glycolyse, maar het middenstuk volume en de mitochondriale inhoud zijn direct gecorreleerd met reproductieve fitness in zoogdieren soorten die grotere mate van competitie tussen mannen voor mates²⁰vertonen. Het aanpakken van deze vragen vereist methoden voor het onderzoeken van de relatieve bijdragen van glycolyse en oxphos tijdens de capaciteitstoewijzing van sperma.

Tourmente et al. paste een 24-Well extracellulaire flux Analyzer aan om het energiemetabolisme van nauw verwante muis soorten te vergelijken met significant verschillende sperma prestatieparameters²¹. In plaats van het rapporteren van de basale ECAR en OCR waarden van niet-bekwame sperma, hier, we passen hun methode met behulp van een 96-well extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de muis sperma capaciteit in real-time te bewaken. We ontwikkelden een methode die gelijktijdige controle van glycolyse en oxphos in real-time in sperma mogelijk maakt met het verslaan van flagella in maximaal twaalf verschillende experimentele omstandigheden door het meten van de flux van zuurstof (O₂) en protonen (H⁺) (Figuur 1a). Als gevolg van de afbraak van pyruvaat tot lactaat tijdens de glycolyse en de productie van co₂ via de TCA-cyclus, niet-bekwaam en bekwaam sperma extruderen H⁺ in de assay media die worden gedetecteerd door de extracellulaire flux Analyzer via H⁺-gevoelige fluor Foren geïmmobiliseerd tot de sondepunt van een sensor cartridge. Parallel, O₂ verbruik door oxidatieve fosforylering wordt gedetecteerd via O₂-gevoelige fluoroforen geïmmobiliseerd tot dezelfde sonde tip (Figuur 1b). Effectieve detectie van de vrijgegeven H⁺ en verbruikt O₂ vereist een gemodificeerde sperma buffer met lage buffercapaciteit zonder bicarbonaat of fenolrood. Dus, om te induceren van de capaciteit in de afwezigheid van bicarbonaat, we adopteren het gebruik van een cel-permeabel kamp analoog geïnjecteerd samen met de breed-Range PDE inhibitor IBMX²². Drie extra onafhankelijke injectie poorten maken de injectie mogelijk van farmacologische activatoren en/of remmers, die real-time detectie van veranderingen in cellulaire ademhaling en glycolyse snelheid vergemakkelijkt als gevolg van experimentele manipulatie.