注:この洗剤スクリーニングのプロトコルは、出発材料としてHEK293細胞ペレットの30 gについて詳述されています。 1. 材料、化学薬品、試薬 注:すべてのソリューションは、25°Cで18.2 MΩ∙cmの抵抗に達するために脱イオン水から精製された分析グレード試薬と超純水を使用して調製されます。 バッファストックソリューション 10倍のリン酸緩衝生理食塩分(10x PBS)を準備します。 HEPESバッファーを準備する:1 M、NaOHでpH 7.5に滴定する。 5 M NaClを準備します。 2 M MgCl2を準備します。注:すべてのストックソリューションは、無菌性を維持するために0.22 μmフィルタを通過します。 洗剤ストックソリューション ドデシルマルトシド(DDM)、10%(w/ v)を準備します。 デシルマルトシド(DM)、10%(w / v)を準備します。 6-シクロヘキシルヘキシルマルトシド(Cymal-6)、10%(w/v)を調製します。 5-シクロヘキシル-ペンチルマルトシド(Cymal-5)、10%(w/v)を調製します。 ノニルグルコシド(C9G)、10%(w/v)を調製する。 ラウリルマルトースネオペンチルグリコール(LMNG)、5%(w/v)を準備します。 デシルマルトースネオペンチルグリコール(DMNG)、10%(w / v)を準備します。 シマル6ネオペンチルグリコール(C6NG)、10%(w /v)を準備します。 シマル-5ネオペンチルグリコール(C5NG)、10%(w /v)を準備します。 オクチルグルコースネオペンチルグリコール(OGNG)、10%(w / v)を準備します。注:10%の洗剤ストック液の場合は、1gの洗剤粉末を超純水に緩やかな揺れで溶かし、最終量を10mLに調整します。洗浄剤のストック溶液は、長時間保存時および作業中の氷上で-20 °Cに保つ必要があります。注意:ボトル洗剤は、通常、-20°Cの冷凍庫に保管することをお勧めします。洗剤粉末を含むボトルは、開封前に室温まで温める必要があります。洗剤粉末は吸湿性であるため、温度平衡化は、洗剤を濡らす結露の形成を防止します。 その他の化学薬品・試薬 1D4免疫親和性アガロース樹脂を調製:50%スラリーの10mL。注:1D4免疫親和性アガロースは、ペプチドとしてウシロドプシンTETSQVAPAの最後の9アミノ酸を結合するモノクローナルRho1D4抗体と結合したアガロースビーズです。1D4免疫親和性アガロースは、C末端1D4配列を含むタンパク質を捕捉するためのアフィニティー精製材料として機能します。この精製材料は、9、11、11または購入して調製することができる。9 9-シスのレチ溶液を調製:1 mM、100%エタノールに溶解する。注:準備および貯蔵の間に、光がレティナルにさらされるのを防ぎます。 1D4ペプチド(配列TETSQVAPA)を調製する:800 μM、水に溶解。 バッファー注:すべてのバッファーは、ストック溶液から所望の濃度に混合されます。すべてのバッファーは、使用前に4°Cに冷却されます。 バッファ A を準備する: PBS, 0.04% DDM. バッファBを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.04M。 バッファCを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、および洗剤を表1に記載されているそれらの作業濃度で。 バッファDを準備する:20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl。 溶出バッファーを準備する: 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 ペプチド, その作業濃度で洗剤. SECバッファを準備する:20 mMヘペスpH 7.5、150 mM NaCl、0.025M;0.22 μm フィルターを通して濾取される。 LC-MS用溶剤 溶媒Aを調製:0.1%のギ酸を含有するアセトニトリル。 溶媒Bを調製:0.1%のギ酸を含む超純水。 溶媒C:イソプロパノールを調製する。 2. 細胞膜可溶化とタンパク質抽出 HEK293 GnTIの30gの解凍-ウシロドプシン変異体N2C/M257Y/D282C3を3発現する細胞ペレット、9を室温に、ダオンホモジナイザーまたは電気ホモジナイザー(13,000rpm)を使用してプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホモジナイズを含む1x PBSバッファーの120 mLを加える。均質化された細胞懸濁液をビーカーに集め、音量を150 mLに調整します。注:細胞ペレットの30 gは、2 x 106細胞/mL密度での細胞培養の3 Lに相当します。 均質化した細胞に10%のDDMを加え、最終濃度1.25%を与えます。氷の上で1時間かき混ぜます。 4°Cで細胞溶解物を遠心分離し、45分間150,000xgで、不溶化した破片を除去する。 g 上清を500mLボトルに移し、1D4免疫親和性アガロース樹脂(50%スラリー)を10 mL加えます。可溶化した細胞溶解物と樹脂を4時間または4°Cで一晩穏やかに混ぜます。 溶出/樹脂混合物を開いたカラムに積み込んで樹脂を回収します。 洗浄バッファーAの10カラム体積(CV)で樹脂を洗浄します。注:列のボリュームは、パックされたボリューム(100%)アガロース樹脂を使用。この場合、1 CVは5mLです。 バッファAの2CVで樹脂を再懸濁します。注意: ステップ 2.8 以降、薄暗い赤色光条件下で実行する必要があるステップは、説明の冒頭に「[Dark]」と表示されます。 [暗い]再懸濁樹脂に9-シスのレチナルを加えて、50μMの最終濃度にします。暗闇の中で4〜16時間、4°Cで軽く混ぜます。注意:潜伏時間が短い場合、レティナルの再構成が不完全になる可能性があります。 [暗い]列からフロースルーを削除します。20 CVバッファAで樹脂を洗浄し、続いて15個のCVバッファBを洗浄します。 [暗い]2 CVバッファBで樹脂を再懸濁し、その後、樹脂懸濁液を10個の10mL廃棄カラムに均等に分割する。 [暗い]カラムから流れを取り除き、1 mLバッファーCで樹脂を再懸濁し、4°Cで1時間インキュベートします。 [暗い]ステップ 2.11 を繰り返します。 [暗い]カラムから流れを取り除き、各カラムの0.8 mL溶出バッファーで樹脂を再懸濁します。2時間とやさしく混ぜます。 [暗い]2 mLチューブにカラムからの溶出を収集します。 [暗い]各カラムの溶出バッファーの0.7 mLで樹脂を再懸濁します。1時間はやさしく混ぜます。 [暗い]同じチューブにカラムからの溶出を収集します。 3. UV-VIS分光法 分光光度計を250~650 nmの測定範囲に対応できるように準備します。水または溶出バッファーを使用してベースラインを記録します。 [暗い]溶出したタンパク質をクォーツキュベットにロードします。タンパク質サンプルのスペクトルを測定します。 [暗い]495 nmのロングパスフィルターを通過した光で、キュベット内でタンパク質を2分間直接照らします。 照らされたサンプルのスペクトルを測定します。 他の9つの洗剤で精製されたすべてのタンパク質サンプルに対して同じ測定を行います( 暗い状態と照らされた状態の両方)。 X-Y 散布図で曲線(吸光度対波長)をプロットします。 4. ロドプシンとロドプシン-mini-G複合体の自動サイズ排除クロマトグラフィー [暗い]分子量カットオフ(MWCO)を4°Cで30kDaとしたスピン濃縮器を用いて遠心分離によりタンパク質を100μLに濃縮する。濃縮されたサンプルは、濃縮器またはバッファーCからの流れを使用して希釈することができる。タンパク質サンプル濃度を測定するには、分光光度計を用いて280nmで吸光度を測定します。注: ステップ 4.2 以降では、実験は暗い環境を必要としないため、サンプルは通常の光の下で準備できます。 各洗剤の状態に対して0.7mg/mLで100μLのロドプシンを調製します。 各洗剤条件に対して100μLのロドプシン(0.7 mg/mL)とミニGo4、12(0.2mg/mL)混合物を調製します。o4,121 mM MgCl 2 で混合物を補います。495 nmのロングパスフィルターからの光で混合物を照らし、30分間インキュベート。 液体クロマトグラフィー精製器に球状タンパク質の分画範囲10~600kDaの24 mLゲル濾過カラムを取り付けます。SEC バッファでカラムを平衡化しました。メモ:液体クロマトグラフィー精製器には、オートサンプラー、複数波長検出器、および分画コレクターが装備されています。 オートサンプラーバイアルにサンプルを移し、サンプルトレイに入れます。各サンプルに対して連続的なSEC実行を自動化するメソッドファイルをプログラムし、オートサンプラーはサンプルの77 μLをカラムにロードし、浄化器は1回のランで0.5 mL/minの流量でSECバッファの24 mLを溶出させます。280 nm および 380 nm で吸光度を記録します。 ロドプシンとロドプシン-ミニG複合体のピーク画分を12.9 mLの保持体積で収集します。 ステップ4.2の左ロドプシンサンプルと、4-12%SDS変性勾配ゲルのロドプシン-mini-Go複合体のピーク画分をクマシーブルー染色で分析します。 溶出クロマトグラム(A280またはA380対保持量)をプロットします。 5. 脱糖分解とLC-MSの研究 LC-MSの研究では、LMNG洗剤で精製されたロドプシンサンプルのみを使用してください。 1 mg/mL で 200 μL のロドプシンと 0.01 mg/mL の PNGase F13を調製します。よく混ぜて、一晩4°Cでインキュベートします。 1 mg/mL で 200 μL のロドプシンと 0.01 mg/mL の遠気中F1 13を調製します。よく混ぜて、一晩4°Cでインキュベートします。 SDS-PAGEとクマシーブルー染色による消化結果を分析します。 濃縮非治療およびEndo F1処理ロドプシンサンプルとバッファーDでSEC精製を受ける。注: LC-MS の試験用に、少量の洗剤でサンプルを準備します。緩衝剤Dは、任意の洗剤を含まないが、膜タンパク質14からのLMNGの遅い速度のために、ロドプシンは凝集しないであろう。 12.9 mLの周囲の保持体積でピーク分率を収集します。スピンコンセントレータ(MWCO 30 kDa)を使用して1mg/mLに濃縮します。 タンパク質10μgをReprosil 200 C18-AQカラムに注入し、表2に記載されている溶媒組成および設定で線形勾配法を使用してカラムを溶出する。流れは質量分析計の場合は25%、UV検出では75%に分割されます。