ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

動物に関するすべての作業は、ウィリアム・アンド・メアリー大学の機関動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って行われました。 1. 動物のケアと胚の取り扱い ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の皮下注射を成人ゼノプス・レービスの背側リンパ嚢に投与することによって、女性は600U、男性は400Uの用量で自然交配を誘発する。 注射後、少なくとも1匹の雄と1匹の雌のカエルを室温の保持タンクに一晩入れる。産卵は、通常、HCG投与後9〜12時間開始する。 胚を収集します。2~4分の2%システイン(pH 8.0)でやさしく洗ってデゼリー。 0.1xマークの修飾リンガー溶液(MMR)(100mM NaCl、2 mM KCl、1mM MgSO4、2mM CaCl2、5mM HEPES、pHを7.4〜7.6に調整)で胚3倍をすすすります。 胚を0.1x MMRと50 μg/mLゲンタマイシンを含む100mmガラスペトリ皿に移します。プレートあたり50〜100個の胚の密度が適切である。 14 °C ~ 22°C で料理をインキュベートし、胚が目的の発達段階に達するまで発生できるようにします。定期的に未受精細胞や壊死またはプラスチックトランスファーピペットを持つ異常に発達している胚を除去します。注: 一貫性を確保するために、開発ステージングは、Nieuwkoop および Faber16によって定義された形態学的基準に従って実行されます。対象となる段階は、実験フォーカスによって異なります。例えば、主要な神経発達のランドマークは、ステージ14(神経節の発症)、ステージ18(神経管閉鎖の発症)、およびステージ22(テールバッド伸びの発症)に関連しています。 2. 胚解剖と試料調製 溶液調製 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、2 mM CaCl2·2H2O、1.31 mM MgSO4、および 4.6 mM トリスを含む 2 mM Ca2 +溶液を準備します。100 mL溶液ごとに、ペニシリン/ストレプトマイシン1mL(10,000 U/mLペニシリン、10,000 μg/mLストレプトマイシン)を加えます。pHを7.8に調整し、フィルター滅菌します。 116 mM NaCl、0.67 mM KCl、4.6 mM トリス、0.4 mM EDTA を組み合わせて、カルシウムとマグネシウムフリー(CMF)溶液を調製します。pHを7.8に調整し、オートクレーブを調整して滅菌します。100 mL溶液ごとに、ペニシリン/ストレプトマイシン1mL(10,000 U/mLペニシリン、10,000 μg/mLストレプトマイシン)を加えます。pHを7.8に調整し、フィルター滅菌します。 解剖・撮像用プレートの調製 UV滅菌2つの35ミリメートルプラスチックペトリ皿と1つの35ミリメートルの細胞培養皿(材料のテーブルを参照)。 層流フードで作業しながら、2 mM Ca2+溶液の10 mLを含む2つの50 mLプラスチック円錐形チューブを準備します。 層流フードで作業を続け、2 mL の 2 mL の Ca2+溶液を 1 つの 35 mm プラスチック ペトリ皿に、2 mL の 2 mL の Ca2 +溶液を 1 つの 35 mm 細胞培養皿に、2 mL の CMF 溶液を 1 つの 35 mm プラスチック ペトリ皿に追加します。 層流フードの外側では、2つの100ミリメートルプラスチックペトリ皿と1つの35ミリメートルプラスチックペトリ皿をゲンタマイシン(50 μg / mL)で0.1x MMRで満たします。60mmのプラスチックペトリ皿に70%エタノールを充填します。 解解の直前に、Ca2+溶液を含む50mLチューブの1つに0.01gのコラゲーゼBを加えます。よく混ぜ、新鮮な60ミリメートルプラスチックペトリ皿に溶液を転送します。 解剖顕微鏡の助けを借りて、所望の発生段階の胚を同定する。滅菌移動ピペットを使用して、ステップ2.2.4で調製した0.1x MMR+ゲンタマイシンを含む100mmプレートの1つに少なくとも6つの適切な胚を移送する。これは、保持プレートとして機能します。 滅菌トランスファーピペットを使用して、1つの胚を0.1x MMR +ゲンタマイシンを含む第2の100mmプレートに移します。これは、解剖プレートとして機能します。 移動できる年齢の胚(およそ段階23以上)を解剖する場合は、0.1%3-アミノ安息香酸エチルエステルを含む皿にヘタマイシン(50μg/mL)で希釈して、解剖前に各胚を麻酔します。胚が固定化されたら、ゲンタマイシン(50 μg/mL)で0.1x MMRを含む皿に戻し、解剖を続けます。 慎重に胚を囲むビテリン膜を取り除きます。これは、膜を把握するために一対の微細な鉗子を使用しながら、胚を安定させるために鈍い鉗子のペアを使用することによって最も容易に行うことができる。細かい鉗子で慎重に引っ張って、ビテリン膜を剥離します。 微細な鉗子を使用して、胚の後側と腹側の領域を分離する。これは、鉗子を使用して胚を前後軸に沿って「ピンチ」し、半分に切断することによって行うことができます。滅菌トランスファーピペットを用いて、ステップ2.2.5で調製したコラゲターゼ溶液を用いて、60mmプレートに転写する。腹側部分を捨てる。 後方の植物をコラゲターゼ溶液中で室温で1~2分間インキュベートします。解剖プレートにそっと移します。 外胚葉の推定神経組織から残留した内皮および中皮汚染をすべて慎重に除去することによって、解剖を完了する。ステージ22以上の胚の場合、神経管も取り除いて廃棄する必要があります。注:解剖中に必要な場合は、ステップ2.2.4で調製した70%エタノールの皿を使用して鉗子をクリアまたは再殺菌することができます。 解剖が完了したら、ステップ2.2.3で調製したCa2+溶液の35mmプレートに外植物を穏やかに移します。 4 つの外植が収集されるまで、手順 2.4~ 2.9 を繰り返します。 P1000マイクロピペットを使用して、4つの外植植物すべてをCMF溶液を含む35mmプレートに移し、外植植物と空気水界面との接触を避けるように注意してください。すべての外植物がプレートの中央に集まるように皿をそっと渦巻きます。 室温で1時間インキュベートし、外植物が解き合えるようにする。注: 解離を支援するために、0.025% ~ 0.01% のトリプシンを CMF ソリューションに追加できます。これは、古い胚の効率的な解離に必要である可能性があります (ステージ 22 以上). この時点で、少なくとも2つの適切にステージングされた胚は、保持プレート上に残るべきである。ステップ2.2.4で調製したゲンタマイシンで0.1x MMRで満たされた新鮮な皿にこれらの胚を移し、彼らは外植皿に合わせて覆われた料理で邪魔されずに開発することができます。これらの胚は兄弟コントロールとして機能します。 superglue を使用して、ステップ 2.2.3 で準備した 35 mm セル培養ディッシュの底部に、マイクロルール付きカバースリップ (材料の表を参照) を取り付けます。注:カバースリップの端にスーパーグルーの小さなダブを置き、細胞培養皿の下側にしっかりと押し付けます。位置マーキングは、接着剤がグリッドに接触する場所で隠されるため、カバースリップの中央グリッド部分を接着剤から解放することが重要です。 外植植物が1時間解絶した後、P100マイクロピペットを使用して細胞培養皿に移します。皿の格子状部分にできるだけ多くの細胞をプレートするために、皿の表面に近い浅い角度でピペットを保持し、内側に向かってグリッドの隅にピペット先端を配置し、グリッドされたarを横切ってしっかりと細胞懸濁液を排出します理想的には、細胞は密な密なクラスターに沈着します。 細胞がプレートに付着できるように室温で1時間インキュベートする。このインキュベーションが始まると、兄弟コントロール胚の発達段階を決定し、記録する。 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (材料表を参照) を 2 μL の 10% プルロン酸 F-127 酸と組み合わせます。注:Fluo-4 AMは光に敏感で、常に光安全またはホイルで覆われたチューブに保管する必要があります。 インキュベーションが完了したら、サンプルディッシュを暗室または他の光で保護された場所に移動します。マイクロピペットを使用して、皿の端から100μLの溶液を取り除きます。Fluo-4 AM/Pluronic F-127酸のアリコートにこの溶液を加え、ピペットを上下に混ぜ、フルボリュームをサンプル皿に戻します。そっと渦巻き混ぜる。 プレートをアルミホイルで覆い、室温で1時間インキュベートします。このインキュベーションが始まると、兄弟コントロール胚の発達段階を決定し、記録する。 インキュベーションの最後に、2 mM Ca2+の残りの円錐形チューブを使用して、皿から1 mLの溶液を取り除き、2)3 mLの新鮮な溶液を加え、3 mLの新鮮な溶液を加え、3mLの新鮮な溶液を加え、新鮮な溶液を3mL加えます。 3. カルシウムイメージング 注:カルシウムイメージングは、反転共焦点顕微鏡(材料表)を用いて行った。 サンプルプレートを顕微鏡ステージに置き、周囲光の露出から保護するように注意してください。プレートが固定されたら、マーカーを使用してプレートの前面の点にラベルを付け、その後のイメージングで同じ視野を見つけることができます。 顕微鏡でサンプルを見つけ出し(最初に10Xで、次に20倍の倍率で)、画像撮影に適した視野を選択します。理想的な視野はセル密度が高いが、セルが束れているか、個別に区別しにくいほど密度が高くない。 グリッドに定めのカバースリップが見えるように顕微鏡の焦点を調整します。カバースリップに記されている数字は、特定のグリッド軌跡の一意の識別子として機能し、追加のイメージングのために同じ視野を見つけるために使用できます。最初に選択したビューフィールドが数字と重ならない場合は、識別可能な数値がフレーム内に入るまで、変更を取り入れ換えます。 グリッドに準拠したカバースリップに焦点を当てて、選択した視野の明視野画像を撮ります。 フォーカスの設定を調整し、セルにフォーカスを合わせて選択した視野の明視野画像を取ります。 細胞層に焦点を当てて、488 nmレーザーでサンプルを照らす。HV とオフセット値は、各実験に対して最適化して、FITC チャネルで蛍光のダイナミック レンジが検出されるようにすることができます。 2 時間のイメージの場合は、スキャン時間が 3.93 s、間隔が 8 秒の 901 フレームを記録するようにイメージング構成を変更して、イメージを取得します。 イメージングが完了したら、顕微鏡段階からプレートを取り出します。プレートから1 mLの溶液を取り出し、2mLのMEMFA(200mM MOPS、2 mM EGTA、2 mM MgSO4の7.4%ホルムアルデヒド)に交換します。 プレートを室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。このインキュベーションが始まると、兄弟コントロール胚の発達段階を決定し、記録する。 固定が完了したら、プレートからすべての溶液を取り出し、1x PBSの2 mLに交換します。さらに処理するために、プレートを4°Cに保管してください。 4. 遺伝子発現解析:プローブ合成 後述のとおり、in situハイブリダイゼーション用のアンチセンスRNAプローブを生成する。さらに、陰性制御として使用する同一遺伝子に対するセンスプローブを生成する。 プローブテンプレート配列を含むプラスミドDNAを精製するために、鋳型プラスミドを含む細菌グリセロールストックを用いてLBブロスの150mLを接種する。37°Cで一晩または培養が濁るまでインキュベートする。 お好みの方法を用いて細菌培養からプラスミドDNAを精製します。注:我々はプラスミドDNAの高い収率を得るためにマクナリー・ナーゲルミディプレップキットを使用しています。 プラスミドに期待されるインサートが含まれていることを確認するには、制限消化を行い、アガロースゲル上の製品を分析します。未切断のプラスミドは、アガロースゲル上で分析してゲノムDNA汚染をチェックすることもできます。 テンプレートDNAを線形化するには、20 μgのプラスミドDNA、2μLの適切な制限酵素、および1xの適切なバッファーを含む100 μL制限消化反応を設定します。37°Cで少なくとも2時間インキュベートする。 フェノール/クロロホルム抽出を行い、クロロホルム抽出を行うことで、リニアライズDNAを抽出します。 100%エタノールでDNAを沈殿させる。これは、2巻の冷エタノールをサンプルに加え、固化するまで-80°Cでインキュベートすることで迅速に行うことができます(15〜30分)。 冷蔵遠心分離機を使用して、12,000 x g/4 °Cで20分間回転させてDNAをペレット化します。 上清を取り出し、200μLの70%エタノールでペレットを洗います。12,000 x g/4 °Cで5分間スピンします。 上清とエアドライペレットを約5分間取り除き、20μLの1x TEで再サスペンドし、さらに使用するまで4°Cで保管します。 アンチセンスRNAプローブを合成して精製するには、10 mM rCTPの15 μL、10 mM rGTPの15 μL、10 mM rATPの15 μL、10mM rATPの9.75 μL、10mMの1UTM-11材料の5.25μLを組み合わせて、2.5mM rNTPミックスを作成します(UTPの5.25μL)。 ステップ 4.2-4.10 から 4 μg の線形化されたテンプレート DNA を含む 50 μL in vitro 転写反応をセットアップします。 ステップ4.11から2.5 mM rNTPミックスの15μL、5x転写バッファーの10μL、0.1M DTTの5μL、RNAse阻害剤(20 U/μL)の0.5μL、および1.5μLの適切なRNAポリメラーゼ(T3、T7、またはSP6)の。37 °Cで1時間インキュベート。 反応に1.5 μlのRNAポリメラーゼを加え、さらに1時間37°Cに戻します。 反応にRQ1 DNAAseを1μL加え、37°Cで10分間インキュベートしてDNAテンプレートを分解します。 サンプルに30μLの7.5 M LiCl溶液を加えます。ピペットを-20°Cで少なくとも1時間混合してインキュベートする。 冷蔵遠心分離機を使用して、サンプルを14,000 x g/4 °Cで25分回転させます。 上清を取り出し、500 μLの70%エタノールでペレットをすすいでください。14,000 x g/4 °Cで5分間スピンします。 約5分間の上清とエアドライペレットを取り除き、ヌクレアーゼを含まない水を20μLで再栓します。 ハイブリダイゼーションバッファーでサンプルを10 ng/μLの濃度に希釈して、10倍のプローブストックで作成します(50%ホルムアミド、 5x SSC(生理塩水ナトリウムクエン酸;750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0)、1mg/mLトルラRNA、0.1%トウィーン20、1xデンハルト溶液、0.1%CHAPS、10mM EDTA、および100μg/mLヘリン。さらに使用するまで-20°Cで保管してください。 5. 遺伝子発現解析:蛍光インシチューハイブリダイゼーション 注:すべてのワッシュは、滅菌、個別にラップされたトランスファーピペットを使用して約1 mLの溶液で行う必要があります。溶液を取り外したり添加したりする際には、ピペットをプレートの端に配置し、細胞がプレート表面から外れ、失われないように、できるだけ穏やかに行う必要があります。 プレートから1x PBSを取り除きます(ステップ3.10から)。新鮮な1x PBSに置き換え、室温で5分間インキュベートします。 25 mL 0.1 メタトリエタノールアミン(pH 8.0)と62.5 μLの無水酢酸を組み合わせます。よく混ぜます。この溶液で10分間皿を洗います。 プレートを1x SSCで5分間洗います。 プレートを0.02 M HClで10分間洗浄し、細胞を透過させます。 1x PBSで2xをそれぞれ5分間洗います。 溶液を取り除き、ハイブリダイゼーションバッファーの1 mLを追加します(50%ホルムアミド、 5x SSC(750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0)、1 mg/mLトルラRNA、0.1%トゥイーン-20、1xデンハルト溶液、0.1%CHAPS、10 mM EDTA、および100 μg/mLヘパリン)60°Cで少なくとも6時間振とうたってインキュベートする。 ハイブリダイゼーションバッファーを取り出し、750 μLの1x RNAプローブ溶液(ステップ4.19で作られた10xストックを希釈した形)に置き換えます。センスRNAプローブは陰性制御として使用することができる。 60 °Cで8-14時間振と共にインキュベート。 プローブを取り外し、-20°Cで保管します。メモ:1xプローブ希釈は廃棄される前に3回まで再利用することができます。 プレートを0.2x SSCですすいでください。 新鮮な0.2x SSCで60°Cで1時間洗浄します。 プレートを室温に移動し、5分間平衡させます。 プレートを0.2x SSCで5分間洗います。 プレートを1x PBTで15分間洗います。 プレートを1x PBT(0.1%トリトン-x-100)で2%H2O2で1時間洗います。注:このソリューションは光に敏感であるため、実験ごとに新たに作り、光から遮蔽する必要があります。プレートはまた、光からシールドするか、このインキュベーション中に箔付けする必要があります。 プレートを1x TBST(150 mM NaCl、50 mMトリス-HCl、pH 7.5、0.1%トゥイーン-20)で15分間洗います。 マレイン酸バッファーで2%に希釈ブロッキング試薬(100 mMマレイン酸、150 mM NaCl、pH 7.5)。この混合物の細胞を室温で少なくとも1時間ブロックする。 ブロッキング溶液を、マレイン酸バッファー中の2%ブロッキング試薬中1:1,000希釈した抗ジゲオキシンジン-POD抗体に置き換えます。4°Cで一晩インキュベートする。 プレートを3xで1x TBSTですすいでください。 連続ロッキングで1回15分以上の2mLで4倍の洗浄を行います。 連続ロッキングで1回の洗浄につき少なくとも10分間、1x PBTで2xを洗浄します。 薄いCy3-共役チラミド 1:25 1x PBT.この希釈液を750μLで5分間洗います。注:このソリューションは非常に光に敏感であり、プレートは、信号の劣化を避けるために、実験の残りの部分のために、箔付けまたは光からシールドしておく必要があります。 この溶液に0.3%H2O2の2.5μLを加え、連続ロッキングで室温でさらに40分間インキュベートします。 連続ロッキングで1回の15分以上の15分間、1x TBSTで4倍の洗浄を行います。 1x PBTですすい。 1x MEMFA(100 mM MOPS、1 mM EGTA、1 mM MgSO4の 3.7% ホルムアルデヒド)で 1 時間、室温で 1 時間インキュベートして細胞を固定します。 ソリューションを取り外し、1x PBS に置き換えます。プレートを4°Cのホイル容器に入れ、さらに処理するまで保管します。 6. 細胞のイメージング 注:画像化は、逆焦点顕微鏡を用いて行った。 サンプルプレートを顕微鏡ステージに置き、ステップ3.1で作ったマークをステージの前に揃えます。 グリッドに並んだカバースリップが表示されるように画像をフォーカスし、手順 3.4 で撮影したグリッド イメージを基準として、カルシウム画像でキャプチャされた視野に合わせて視野を調整します(セクション 3)。 グリッドとセルの両方の明視野画像を取得します。 595 nm TRITC レーザーでサンプルを照らします。ゲイン値を調整して、負の制御セルからの画像を使用して、背景から信号を適切に区別し、静止画を取得します。注:理想的には、バックグラウンド蛍光レベルは、非標的性センスRNAプローブと並行して処理された陰性制御プレートに基づいて決定されます。ゲイン設定は、このプレートが完全に黒く表示されるように調整され(背景レベルに対応)、その実験バッチからイメージされた他のプレートに対して一定に保たれます。 7. データ処理 注:データ処理はニコンエレメントソフトウェアを使用して行われました。 ステップ3.7から2hカルシウム画像を開きます。[バイナリ] > [スポット検出] > [明るいスポット] を選択して、個々のセルに対応するピクセルを識別します。FITC チャンネルが選択されていることを確認します。 このレイヤーが生成された後、色付きの円が個々のセルに表示されます。セルの分布とサイズのパラメータを調整して、できるだけ多くのセルが認識され、一意の識別子に関連付けられます。 [表示] →[分析コントロール] > [トラッキング オプション] に移動して、画像のすべてのフレームのセルを追跡します。トラック間の最大ギャップとして 5 フレームを設定し、600 フレーム未満のオブジェクトを削除して、[ギャップを閉じる]オプションを選択します。[バイナリを追跡] を選択して、セルトラッキングを画像に適用します。 セルを追跡した後、個々のセルに対応していないオブジェクト (セルの束など) を手動で削除します。しかし、データ点は、カルシウム活性トレースの形態に基づくさらなる分析から除外されるべきではありません。 [イメージ] ペインで、[オーバーレイの表示|バイナリ オブジェクト ID の表示] を選択します。イメージの最後 (フレーム 901) までスクロールし、[編集] → [ビュー スナップショットの作成 ](8 ビット RGB)> [現在のフレーム] > [OK]を選択します。これにより、各セルに関連付けられたバイナリ ID が表示されたイメージの最後のフレームのスナップショットが作成されます。このイメージを保存します。 すべてのオブジェクトを選択し、[データを Excel にエクスポート] をクリックして時系列データをエクスポートします。出力を CSV ファイルとして保存します。 FISH 画像を開きます。FITC チャネルの代わりに TRITC チャネルを使用して、ステップ 7.1 ~ 7.2 のようにスポット検出を最適化します。間違って割り当てられたバイナリを手動で削除し、[自動計測結果] > [計測の更新] を選択して、各セルの信号強度を計算します。手順 7.5 と 7.6 を繰り返して、イメージ スナップショットとデータ テーブルをエクスポートします。 列 A がFISH バイナリ ID、列 B が[カルシウム バイナリ ID]というラベルが付いたスプレッドシートを作成します。ステップ 7.5 および 7.7 でエクスポートされたイメージを開きます。FISH イメージで識別される各オブジェクト (ステップ 7.7) について、列 A にバイナリID を記録します。次に、カルシウム画像 (手順 7.5) で対応するセルを見つけ、列 B にそのバイナリ ID を記録します。メモ:Adobe PhotoshopやGIMP画像エディタなどの写真編集プログラムを使用して、両方の画像を開き、1つの半透明にし、パートナー画像にオーバーレイして、各セルに関連付けられた2つのバイナリIDをより簡単に識別してリンクすると便利です。 同定された細胞ごとに、時系列カルシウムデータ(カルシウムバイナリIDに関連付け、ステップ7.6でエクスポート)とその遺伝子発現データ(FISH Binary IDに関連付けられており、ステップ7.7でエクスポート)を照合します。注: 下流のデータ処理と分析では、これらのデータを単一のデータテーブルに照合し、スパイクカウント、フラクタル分析、およびマルコフンエントロピーを含む一連の分析技術を適用して、研究者がカルシウム活性17、18の新しいパターンを識別することを可能にする。