הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים
Summary
כדי להציג ולכמת את התכונות הפנימיות של קנדידה אלביקנס ביוילאמים, אנו מכינים דגימות שלמות קבוע כי מובהר על ידי השבירה המדד התאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג נתוני תמונה תלת-ממדיים למרות העובי המלא של הנתונים.
Abstract
פטריה חיידקים קנדידה אלביקנס יכול לעבור שינוי מתוך הקולוניזציה המ, התקפה אלימה כי הוא מתואם מאוד עם היכולת שלה לעבור מצמיחה שמרים צורה הצמיחה hyphal. התאים היוזמים תהליך זה הופכים להיות חסיד של משטחים כמו גם זה לזה, עם התפתחות כתוצאה של מושבה של ביוilm. זה מתרחש בדרך כלל לא רק על משטחי רקמות מופאות בזיהומים שמרים, אלא גם על שתלים רפואיים כגון קטטרים. ידוע כי תאי ביו, עמידים בפני תרופות נגד פטריות, ושהתאים שנשפכו מתוך הביוilm יכולים להוביל לזיהומים מערכתית מסוכנים. טווח של ביוילאמים מתוך שקוף למחצה עד אטום בשל השבירה טרוגניות. לפיכך, קשה ללמוד באמצעות ביומיקרופטריה אופטית. כדי להמחיש את התכונות הפנימיות, הסלולר והתת הסלולאריות, אנו מבהירים את המבנה השלם של הממס באמצעות המרת ממיסים מיטביים לנקודת התאמה אופטימלית של השבירה. עבור C. אלביקנס ביודיאמים, הבהרה מספקת מושגת עם מתיל סלימיאוחר (n = 1.537) כדי לאפשר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מן הפיסגה לבסיס ב 600 יקרומטר ביווליאמים עם הנחתה קטנה. בפרוטוקול הדמיה זו אנו מתווה refractometry הניגודיות של הפאזה, התפתחותם של ביוגיאמים מעבדתיים, קיבעון, כתמים, החלפת ממיסים, הכיוונון של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית ותוצאות מייצגות.
Introduction
קנדידה אלביק היא פטרייה מיקרוביאלית שבדרך כלל משמשת כבבני אדם. זה עניין עקרוני לביולוגים כי לאורגניזם יש מורורפולוגיות מרובות. לדוגמה, בתגובה לרמזים סביבתיים מסוימים או לחצים, טופס שמרים לגבש תאים תעבור צמיחה filamentous כמו המחיצה של תאים מאורכים מאוד המכונה hyphae. המעבר חשוב כדוגמה של ביטוי פנוטימית של שינוי מעל בין חד-תאי ומגוון הביטוי גנים ביטויים. כמו כן, ג. אלביקנס הוא בעלי עניין רפואי כי האורגניזם הוא פתוגן ידוע אופורטוניסטי. היא אחראית על זיהומים שמרים רירית כגון (מנומר אוראלי), זיהומים בעלי מין, וגורם לזיהומים פולשנית או מערכתית מסוכן בחולים מוחלשים לוגית.
הפוטנציאל של האורגניזם הזה למען התקפה אלימה קשור באופן הדוק למספר הורגוטיפים שלה ולהיבטים אחרים של הרבגוניות הגנטית שלה1,2,3,4. שפופרת נבט הארכה, השלב הגלוי הראשון של המעבר לצמיחה hyphal, מתרחשת עם מהירות מספקת כדי לאפשר באופן מסיבי C. אלביקנס תאים לפרוץ phagocytes ובכך לברוח שלב מוקדם של התגובה החיסונית הסלולר של המארח5. בנוסף, filamentation לפני ומלווה על ידי עלייה גדולה תא אל התא והדבקות תא לפני השטח כי הוא בשל ביטוי מוסדר של מספר כיתות של הקיר תאים חלבונים המכונה הידכי חטאים6,7,8,9. באמצעות מגוון רחב של תנאים, שילוב הדבקות והfilamentation מביא לשינוי דרמטי מפלאנקוווני, גידול חד-תאי ועד לצמיחה קולוניאלית הקשורה לפני השטח המהווה ביוilm. ג. אלביקנס ביואילאמים עשויים להתפתח על מכשירים רפואיים מושתלים משותפים כגון קטטרים ורידים. זיהומים המופץ יכול לגרום כאשר ביואילאמים כגון להתחיל ניצן את התאים שמרים טופס לשפוך אותם למחזור דם. מחקרים מרובים הראו כי התאים של ביוilm עמידים יותר לתרופות נגד פטריות מאשר תאים פלנקטון10,11, אשר עשוי להיות בשל חלק הוריד את חילוף החומרים12. יתרה מזאת, הדבקות הכוללת של ביוilm עשויה לספק את העיגון הדרוש לצמיחה פולשנית ויעילה של מיקוף לרקמות מארחות1.
הבהרה אופטית של C. אלביקנס ביואילאמים על ידי התאמת המדד התאמה יש השפעה גדולה על היכולת שלנו להמחיש את המבנה של הקהילה החיידקים האלה ולגלות את היחסים בין הביטוי גנים ו פנוטיפים. ביוילאמים הגדלים במעבדה על משטחי מבחן תחת מדיום תרבות נוזלית עבור 48 h מופיעים כציפוי לבנבן מספיק צפוף ועבה מספיק כדי להיות אטום (איור 1). לכן, תכונות פנויואיות מעניינות רבות מוסתרות מהתצוגה. The 24 מסוג פראי ביוילאמים גדל ב YPD, RPMI-1640, או בינוני עכביש ב 37 ° c לטווח של עד 300 יקרומטר עבה, עם 48 ביואילאמים לעתים קרובות להגיע 500 יקרומטר. אטימות היא בשל פיזור אור, אשר עולה מן השבירה טרוגניות: קיר התא פטרייתי הוא השבירה יותר מאשר המדיום המקיף, ואת הציטופלסמה מעט יותר שבירה מאשר קיר התא. הצפיפות האופטית והמתקבלת של המבנה המקורי מסתירה את כל המבנים יותר מ-30 יקרומטר עמוק כאשר הם מוצגים עם מיקרוסקופ קונבנציונאלי או אפילו סורק קונפוקלית וקד (איור 2). עם זאת, מידה גדולה של הבהרה ניתן להשיג על ידי חדירה ביואילאמים קבוע עם השבירה הגבוה מדד נוזל כי בערך שבירה של המרכיבים הסלולריים העיקריים. לאחר הבהרה, ניתן לבצע הדמיה ברזולוציה של תת-מיקרון על ידי המיקרוסקופיה באמצעות מיקרוסקופ באמצעות העובי המלא של כמעט כל C. אלביקנס ביוilm13. בדגימות מסוג פראי, קל לראות כי ביוילאמים מורכבים מhyphae ורכב ארוך, אשכולות של תאים שמרים בצורת מודגש או תאים מדומה, חללים בחלל, וכמות כלשהי של מטריצה המומנת. יתר על כן, ביואילאמים בדרך כלל הם באופן שונה, מציג מרחב הבדלים מורפולוגיים בסוג תא, צפיפות התא, ואת הנוכחות של תאים הנצה או הסתעפות. וריאציות רבות באחת או יותר מהתכונות הללו נצפו ב ביויואמים שפותחו עלידי זניםמוטנטים 14,15. בנוסף, זנים העיתונאי להראות באתרו הבדלים מרחביים ביטוי גנים16,9,13. המידה המפתיע של הבהרה השגה עם גישה זו פשוטה יחסית וזולה גם מאפשר לראות כי ביוגיאמים רבים כוללים לקורבן ומיקוף פולשנית בסיס הארכת למרחקים מילימטר.
בפרוטוקול הדמיה זו, אנו מדגימים את התיקון, התיוג, ההבהרה והדימות של ביויוגים של C. אלביקנס באמצעות סמן תא בקיר פשוט ככתם. מקורו של הגרסה הנוכחית של הפרוטוקול הוא בהירות משופרת שראינו כאשר מפורמלדהיד-ביואילאמים קבוע שחדרו עם 97% גליקול מתיונין (גמה), אשר היה לאחר מכן להטביע את הביוilm בפלסטיק קשה בעל מדד השבירה הגבוה בינוני (n = 1.49). לאחר מכן השתמשנו במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה רגילה ובסדרה של שבירה הפניה לנוזלים באופן מדויק יותר לקבוע את הנקודה של היפוך ניגודיות (שקיפות מרבית) של הביוilm (איור 3). עבור C. אלביקנס ביוילאמים זה קרה קרוב n = 1.530, אשר היה גבוה באופן מפתיע בהתחשב בכך מבנה חלבון צפוף כגון קרטין שיער הוא רק מעט השבירה (1.54 – 1.55). למרות שהוא בקצה העליון של הטווח האופטימלי באיור 3, אימצנו מתיל סלייסק (שמן של וינטרגרין, n = 1.537) בפרוטוקול הנוכחי, משום שהוא כבר משמש כסוכן הבהרה למיקרוסקופיה באמבריולוגיה והיסטולוגיה, יש הרעלה נמוכה ולחץ אדי נמוך, וזה נתן תוצאות מצוינות בניסויים שלנו באמצעות
4 נקודות יש לעשות כאן:
(1) עם כמה יוצאים מן הכלל, המצב האידיאלי במיקרוסקופיה היא כי מדד השבירה של הדגימה צריך להיות שווה את מדד השבירה של העדשה המטרה טבילה נוזלים17,18,13. עבור שלושה מימדים (3D) לימודי הדמיה שבהם התמקדות עמוקה היא הכרחית, זה תמיד חשוב.
(2) התוצאה הניסיונית שלנו לניקוי אופטימלי (n = 1.525 – 1.535) היא מעט גבוהה יותר מאשר שמני טבילה סטנדרטיים (n = 1.515, 1.518) ולכן המפר נקודה (1), ובכך מציג מקור של סטייה כדורית בעת שימוש רגיל שמן טבילה אופטיקה. פתרון אחד לבעיה זו הוא שימוש במטרה המיועדת לאינדקס טבילה בטווח הגבוה יותר. בגלל תחיית העניין בדגימות הדמיה, המטרות הייחודיות עם התיקון הדרוש הופכים לזמינים. הפתרון השני הוא להתאים את האינדקס של הבינוני להבהרת עד 1.515 או 1.518 על-ידי תוספת של כמות קטנה של butanol (n = 1.399) לביצועים מיטביים טבילה בשמן, ולקבל את הבהירות מושפל מעט.
(3) מיקרוסקופ של ביוילאמים שלמים (ודגימות אחרות בקנה מידה זה) דורש מרחק עבודה משמעותי כדי להתאים את עובי הדגימה. זהו שיקול מעשי משמעותי. מרחק עבודה ארוך מגביל את האופטיקה לצמצם מספרי מתון (NA = 0.6 – 1.25), אשר מגביל את הרזולוציה, אך גם מגביל את חומרת סטייה כדורית.
(4) מפתח השבירה האופטימלי להבהרה עשוי להיות שונה מסוגים אחרים של דגימות קבועות. יש לבדוק את הדגימות בהתאם לעומת הפאזה וסדרת השבירה של החומר כמוצג באיור 3.
Protocol
Representative Results
Discussion
התקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהפרדה אופטית, רזולוציה, מהירות, הימנעות או פיצוי של סטייה, רכישת רב-ערוצי, ובכוח המחשוב, גרמו לתחייה בהדמיה בדגימות שלמות. לדגימות קבועות, הן הבהרה קלאסית והן רומן שיטות הרחבה היתה השפעה גדולה19,20,21,22,23,24. במקרה זה, התחלנו התאמה מהירה ופשוטה המבוססת על מדד ההתאמה כדי ללמוד את המבנה של ביוגיאמים פטרייתי כי הם שקופים בכבדות לאטום.
הפרוטוקולים הקודמים נבדקו עם מגוון של דגימות. ב מעבדה שלנו קנדידה ביוביאמים בעלי לרוב גדלים על 14 מ”מ ריבועים לחתוך מתוך גיליון של גומי סיליקון בכיתה רפואית (ראה לוח חומרים). שכבת משנה זו משמשת מכיוון שהגידול ב-PDMS (פולי דימתיתיל siloxane) שקוע במדיום תרבות נוזלית הוקם כמודל חשוב במיוחד עבור זיהומים הקשורים שתלים רפואיים, בעיקר קטטרים שכינתה. תאים הדגיש ייזום filamentation לדבוק במהירות משטחים שאינם קוטבי כגון PDMS. בפועל, משבצות משומשים שנוקו ומחוטאת מחדש במחזור החיטוי (מחזור יבש) נותנים את הביואמים העקביים ביותר עבור כל זן מסוים. ביואילאמים מגודלים גם בדרך כלל על משקפי כיסוי, במנות מהמטבח התחתון של המטבח, בפוליסטירן מוקצף סטנדרטי בקטיולוגי ובאגר. מכיוון ש -C. אלביקנס תאים לא לדבוק היטב זכוכית, משקפיים לכסות צריך להיות מטופלים עם לקטין כי יהיה לאגד את הקיר מפיברגלס. אנו מחילים 40 μL של 1 מ”ג/mL קונה או WGA במים סטריליים על כל משטח coverslip. לאחר ייבוש, משקפי כיסוי מטופלים עם 40 μL של 1% גלוטארלדהיד עבור 3 דקות כדי להצליב את החלבון לתוך סרט לא מסיסים. לאחר מכן הם נשטפים עם מים מזוקקים סטרילי כדי להסיר את הקבע ואת כל לקטין מסיסים ומיובשים האוויר. במקרה הצורך, משקפי הכיסוי שטופלו או מנות מטוהרים מחדש תחת מנורת UV קוטל חידקים עבור 10 דקות.
עובי הדגימה ישפיע על תקופות הדגירה הנדרשות בפרוטוקולים. הדיפוזיה הfixative לתוך ביוilm של 300 יקרומטר דורשת מספר דקות כדי להתמצא. תקופה זו הזמן מגדילה כריבוע של עובי הדגימה, ויש להרחיב לשעה או יותר עבור ביואילאמים עבה מאוד או בלוק לחסום דגימות שעשוי להיות 2 – 3 מ”מ עובי. תקופת הזמן הequiציה עבור הצביעת גם תלויה בעובי הדגימה כמתואר לתיקון וכשלון. עם זאת, כיוון שהפחיות מוארכים לאט יותר מאשר התוספות הנמוכות, במיוחד בתוך ג’ל אגר, יש להאריך בין לילה. אותו הדבר צריך להיעשות לכישלון של הכתם העודף.
כתמים מסוגים שונים עשויים להיות שולבו בפרוטוקולים. אנו משתמשים כתם תא הקיר עבור דימות מבניים, הנפוץ ביותר Calcofluor לבן M2R (Fluor. בריאר #28) או צבע מתויג לקטין כגון קונה-Alexafluor 594 או WGA-Alexafluor 594. שימו לב, יש לשלם את הטיפול בחלבון. הקונה הטטרמר עלול לגרום ליצירת קשר בין מיקוף גמיש ביותר באזור האפיאני של ביוilm. זה פחות ברור עם ה-WGA dimer. הסממנים הקאנוניים של הסמנים הללו הם קלקופלואור עבור כיטין, קונה עבור שאריות מנוז, ו-WGA לצורך שאריות החומצה הדו-מרחצילית-D-גלוקוסמורין.
מאחר שפרוטוקול החלפת הממס מדורגת מ-PBS או מהמים, למרות שמתנול לתוך מתיל סלימאחר, מכולות הדגימה חייבות להיות עמידות בפני ממס. מתיל מאוחר (MS) מרכך במהירות פוליסטירן פלסטלינה ומרכך באיטיות חומרים פלסטיים אחרים. שלבי הפרוטוקול עד לשימוש מתנול מסודר ניתן לבצע ב פלסטלינה, אבל בשלב זה בפרוטוקול אנחנו בדרך כלל מחליפים לתקן 20 מ ל הזכוכית המבחנות עם ברגים עמידים ממס. הבקבוקונים נוחים עבור ביואילאמים על תת מרובעים סיליקון מרובע, כי הריבועים ניתן לאסוף ולהעביר באמצעות פינצטה עדין. כמו כן, ניתן לרוקן בקבוקון ולמולא עם הריבוע השטוח השוכן על המשטח המעוקל הפנימי, כך שיורואים אינו מתקשר לזכוכית. שכבת המשנה צריכה להיות ביואושל-up כאשר היא שקועה בבקבוקון הזקוף. הבקבוקונים מצוינים לאחסון. דגימות לטווח ארוך
בפרוטוקול הבהרה, יותר מדורגים שלבים החליפין הממס למזער את הסיכון דפורמציה הדגימה עקב אפקטים ערבוב ממס. עבור מהירות ונוחות בפרוטוקול הבסיסי, ישנם ארבעה שלבים: 1) צעד 3.3, PBS כדי 50:50 PBS: מתנול; 2) שלבים 3.4 ו 3.5, PBS: מתנול כדי מתנול מסודר, 3) צעד 3.6, מסודר מתנול כדי 50:50 מתנול: MS; ו 4) שלבים 3.7 ו 3.8, מתנול: MS כדי מסודר MS. מתנול מספק את חוסר המעבר. עם זאת, בגלל מים ו-MS כמעט immiscible, זה חיוני כי כל המים להיות עקורים על ידי מתנול לפני המבוא של כל MS. כמו כן, כי מתנול הוא הפכפך מאוד, חשוב לעבור את כל מתנול על ידי MS. אחרת, המשך אידוי מתנול שיורית יגרום שבירה וריאציות מדד בתוך הדגימה. במסגרת רצף ארבעת השלבים, חוזר על הצעדים השני והרביעי על-ידי הוספת שינוי נוסף של ממיס מסודרת, או אפילו שינוי שלישי, מומלץ. לדגימות שבירות במיוחד, ניתן לניסח שינויי ממיסים בשלבים קטנים יותר.
עם דגימות לחסום אגר, שלבים 3.4 ו 3.5 (מסודר מתנול) עלול לגרום המראה של גבישי מלח בתוך אגר בשל חוסר מסיסות של מלחי PBS שיורית במתנול. זה יכול להיות נמנע על ידי שימוש במים מזוקקים (DW) בשלב הראשון מעורב הממס במקום PBS לדלל מלחים במהלך המים: מתנול exchange. רצף החליפין חלופה חלופית עבור ביואילאמים קבוע אז מורכב משלבים אלה: 1) צעד 3.3, להעביר את הדגימה מ-PBS לתוך 50:50 DW: מתנול (לאפשר זמן נוסף עבור דיפוזיה דרך אגר); 2) צעד 3.4, להעביר את הדגימה מ 50:50 DW: מתנול לתוך מתנול מסודר (לחזור על 2x עם מתנול כמו בשלב 3.5); 3) שלב 3.6, להעביר את הדגימה מ מתנול כדי 50:50 מתנול: מתיל סליייתאחר; ו 4) צעד 3.7, להעביר את הדגימה מ 50:50 מתנול: MS כדי MS מסודר (לחזור על 2x עם MS כמו בשלב 3.8).
בגלל שמתיל סליייסוף במהירות מרכך פוליסטירן מפלסטיק, אנו משתמשים בצלחת אלומיניום עם תחתית זכוכית כיסוי כדי להחזיק את הביוilm הבהיר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. הזכוכית המכסה מוחזק במקום באמצעות UV-ריפוי בטון אופטי (נורלנד #61 דבק אופטי, ראה לוח חומרים). בתנאי MS מוסר בסוף היום על ידי שטיפת הצלחת עם איזופנול ואחריו מים סבון ושטיפה, זכוכית לכסות חיזקו יהיה לשרת במשך חודשים רבים.
בחירת העדשה האובייקטיבית חשובה באופן קריטי בהדמיה בקנה מידה גדול של דגימות מובהר בשל החשיבות של מזעור סטייה כדורית ואת הצורך במרחק עבודה מספיק. יש לנו ניסיון עם שלוש מטרות במחקרים אלה. בכיוונון מיקרוסקופ הפוך, אנו משתמשים במרחק עבודה ארוך, מתון הצמצם מספריים (NA) שמן אובייקטיבי שקוע מתחת לזכוכית המכסה עם הביוilm שקוע במתיל סלייימאוחר בצלחת מעל זכוכית העטיפה. רוב העבודה שלנו נעשה עם המטרה האוניברסלית Zeiss סדרה מטרה, סוג 461708, 40x 0.85 NA Oel 160/1.5, משמש עם מתאם שלילי 160 מ”מ אורך מוקד עבור הנומינלי המשלים אינסופי (IC) תאימות. מטרה זו במקור תוכנן עבור שמן שקוע צפייה דרך מיקרוסקופ 1.5 מ”מ עם 0.35 mm מרחק עבודה25. כאשר משתמשים עם זכוכית כריכה סטנדרטית (0.17 מ”מ), מרחק העבודה הוא הרבה יותר: 1.5 + 0.35 – 0.17 = 1.68 mm = 1,680 μm. אנו משתמשים גם מטרה מרובת טבילה חדשה של Zeiss, סוג 420852, 25x 0.8 NA LD LCI תוכנית-apochromat עם מרחק עבודה העולה על 540 μm, עם תיקון טבילה להגדיר את הצד הגבוה של ‘ שמן ‘. מטרה זו מתוקנת מאוד ומייצרת תמונה מעולה. על דוכן מיקרוסקופ זקוף, השתמשנו מטרה מרובת טבילה חדשה של ניקון, סוג MRD71120, 10x 0.5 na cfi תוכנית-apochromat עם מרחק עבודה יעלה 5,000 יקרומטר (5 מ”מ), גם עם תיקון טבילה להגדיר את הצד הגבוה של ‘ שמן ‘ (n = 1.518). למרות מטרה זו יש NA נמוכה יותר מהאחרים, יש לו את היתרון של להיות ישירות מתוך מתיל סלימיאחר.
כדי לייעל את רכישת הנתונים במונחים של מהירות ורזולוציה, הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באופן אידיאלי צריך לעמוד הן מדגם נייקוויסט רוחבי ו-צירית בצפיפות18. באמצעות קריטריונים קונבנציונליים, הגדר את קוטר החור החרוט ליחידה אוורירית 1. , בקואורדינטות מוגדלות
dP (μm) = 1.22 x הגדלה x (אורך גל פליטה ב-μm)/NA
דגימת רוחבי (מרווח בין פיקסלים) לא תעלה על (1/2) x מגבלת הרזולוציה של אבה. בקואורדינטות של מרחב האובייקטים,
∆ x, ∆ y = (פליטה אורך הגל בננומטר)/(4 NA)
דגימת ציר (התמקדות בתוספת קבועה) לא תעלה על רוחב הפס ההופכי של הציר,
∆ z = (אינדקס טבילה) x (אורך גל פליטה בננומטר)/(NA2)
המערכת האופטית הקונקלית מרחיבה את רוחב הפס של המיקרוסקופ ומחדדת הן את הרזולוציה הרוחבי והצירית על ידי לפחות 1/√ 2.
עבור המטרה 40x 0.85 NA שאנו מנצלים בדרך כלל, לראות את הטבלה 1 עבור התוצאות של נוסחאות אלה עבור מ600 הפליטה ננומטר גל (אלקסה fluor 594).
| נוסחה | x 1/√ 2 | set (אופיינית) | |
| dP (μm) | 34.5 יקרומטר | – | 25 או 50 יקרומטר |
| ∆ x, ∆ y | 176 ננומטר | 125 ננומטר | 161 ננומטר |
| ∆ ז | 1200 ננומטר | 848 ננומטר | 900 ננומטר |
שולחן 1: קוטר מוקד מיקוד, דגימה לרוחב, וערכי דגימה צירית באורך של 600 ננומטר.
באמצעות סורק מסתובב בדיסק עם הגדרות אלה ושדה 1,392 x 1,040 פיקסל לסרוק השדה, נתונים מתוך דגימות של ביוilm ניתן לרכוש עם מהירות סבירה ורזולוציה. אופייני לתמונות תלת-ממד של התמונה מ0.35 – 1.55 GB.
הבהרת מדיה בטווח רחב של שימוש משמעותי בתחום השבירה. על ידי התאורה ושלכת ובדיקה חזותית, מצאנו את התקן C. אלביקנס ביואילאמים היו שקופים ביותר מעל n = 1.5. זה היה מעודן על ידי מיקרוסקופ ניגודיות הפאזה n = 1.530 – 1.535. עבור מספר סיבות מעשיות, אנו משתמשים במתיל סלייימה (n = 1.537) כמו המדד הסופי התאמת הממס. למרות החליפין ממס מביא את הסיכון של דפורמציה הדגימה או חפצים אחרים, תאים קבועים, הבהיר דגימות יש מידות דומות גוף התא, hypha קוטרו, ו-interseptal מידות אורך כמו יצורים חיים.
וריאציות רבות בתהליך החלפת הממס אפשריות (לדוגמה, שימוש בממיסים שונים או מממס סופי שונה). מתנול נבחר קוטביות גבוהה ודיפוזיה מהירה, אבל אתנול הוכח לשמר טוב יותר חלבון פלורסנט אדום (RFP) התשואה הקוונטית26 כממס המעבר. מתיל מאוחר נבחר עבור האינדקס שלה, קוטביות מתונה, לחץ אדי נמוך, ותאימות עם כתמים רבים, צבעים, וחלבונים פלורסנט. עם זאת, הממס הסופי עם אינדקס מעט נמוך יותר, או תערובת של מתיל סלימאוחר וממיסים המדד נמוך יותר, כגון butanol, עשוי לשרת טוב יותר.
באופן בלתי צפוי, היכולת לראות דרך מבנה המבנה חושף לא רק את התכונות הפנימיות שטרם עברו, אלא גם מסייעת להציג את מקורם של מבנים מורחבים כגון מיקוף ארוך ומלא-מסובכת, ומיקוף בסיס פולשני בשכבות משנה מסוימות. התקפה של אופורטוניסטית ב -C. אלביקנס תלוי ברב-תכליתיות הגנטית שלה (כלומר, המעבר אל הצמיחה hyphal, upregulation של תא טקטי תשתית כבה ותא תא התא, הדור של osmolytes עבור התבגרות תא התארכות, ושימוש בחומרים מזינים חלופיים). הארכה hyphal מאפשר הפריצה של בודדים C. אלביקנס תאים מתאי החיסון phagocytic אלא גם חיוני לפלישה. שזירה הדבקה ומיקוף של ביו, מופיעות כדי לספק את המשטח הנדרש כדי לחדור ביעילות לשכבה משנית. כאשר שכבת המשנה היא רקמה מארחת, התקפה אלימה מוגברת עלולה לגרום.
הדמיה שלמה ביואילאמים מאפשר מספר עצום של ניסויים אינפורמטיביים ניצול זנים הכתב לביטוי גנים, מודל משנה רקמות, והכללת אורגניזמים אחרים כגון חיידקים שנמצאו ביואילאמים טבעיים. גם במקרה הפשוט ביותר של הדמיה מבנית גרידא עם כתם קיר תא, באתרו פנוטיפים מתגלים כי אז ניתן לכמת ומנותח גנטית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי NIH מענקים R01 AI067703, R21 AI100270, ו R21 AI135178 ל-א. פ. מיטשל. המחברים אסירי תודה לגרינפילד ‘ קיפ ‘ סלודר לספק את היעד הארוך לטבילה בשמן הרחוק המשמש בעבודה זו, ודניאל Shiwarski למיקרוסקופיה מיקרוסקופית עם טבילה ישירה מתיל.
Materials
| Biohazardous waste receptacle | |||
| Biosafety cabinet with germicidal UV lamp | |||
| Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol) | |||
| Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Distilled water | DW | ||
| Distilled water, sterile | |||
| Ethanol, absolute | EtOH | ||
| Fetal bovine serum (FBS), sterile | |||
| Fixative waste bottle in secondary containment | |||
| Formaldehyde 20% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% | Electron Microscopy Sciences | ||
| Fume hood | |||
| Glutaraldehyde 25% in water, ampules | Electron Microscopy Sciences | ||
| Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes | |||
| Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates | |||
| Isopropanol 70% | iPrOH 70% | ||
| Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt | Cole-Parmer Scientific | for curing NOA-61 cement | |
| Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick | Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ | Non-reinforced medical grade silicone sheeting | |
| Methanol 99.9% | MeOH | ||
| Methyl salicylate 99% | MS | ||
| Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets | Millipore Corp. | SX0001301 | |
| Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 | Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com | NOA-61 | |
| Orbital mixer, benchtop | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | |||
| Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) | Cargille Laboratories, https://cargille.com | Series E | Cedar Grove, NJ 07009, USA |
| RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile | |||
| Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner | Fisher Scientific Co. | 03-341-25H | for specimen processing and storage |
| Solvent waste bottle in secondary containment | |||
| Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol) | |||
| Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate | |||
| Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar) | |||
| YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose) |
References
- Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
- Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
- Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
- Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
- Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
- Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
- Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
- Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
- Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
- Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
- Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).
- Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
- Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , 48 (1971).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).
