3D Многоцветный инструмент ДНК FISH для изучения ядерной архитектуры в первичных клетках человека
Summary
3D многоцветная ДНК FISH представляет собой инструмент для визуализации нескольких геномных локусов в 3D сохранившихся ядрах, однозначно определяя их взаимные взаимодействия и локализацию в ядерном пространстве на уровне одной клетки. Здесь описывается протокол шаг за шагом для широкого спектра первичных клеток человека.
Abstract
Важным вопросом в клеточной биологии является геномная организация в ядерном пространстве и то, как архитектура хроматина может влиять на такие процессы, как экспрессия генов, клеточная идентичность и дифференциация. Многие подходы, разработанные для изучения 3D-архитектуры генома, можно разделить на две взаимодополняющие категории: технологии захвата хромосомы (C-технологии) и визуализации. В то время как первый основан на захвате хромосомы конформации и проксимальных взаимодействий ДНК в популяции фиксированных клеток, последний, основанный на флуоресценции ДНК на месте гибридизации (FISH) на 3D-сохраненных ядер, позволяет современную визуализацию несколько локусов на уровне одной клетки (многоцветный), изучая их взаимодействия и распределение внутри ядра (3D многоцветная ДНК FISH). Техника 3D многоцветной ДНК FISH имеет ограничение визуализации лишь нескольких предопределенных локусов, не позволяя всесторонний анализ ядерной архитектуры. Однако, учитывая надежность его результатов, 3D многоцветная ДНК FISH в сочетании с 3D-микроскопией и реконструкцией изображения является возможным методом проверки результатов на основе C-технологий и однозначного изучения положения и организации конкретных локусов на уровне одной ячейки. Здесь мы предлагаем шаг за шагом метод 3D многоцветной ДНК FISH подходит для широкого спектра основных клеток человека и обсуждаем все практические действия, важные шаги, понятия 3D-изображения и анализа данных, необходимых для получения успешного и информативного 3D многоцветного ДНК FISH в различных биологических контекстах.
Introduction
Высшие эукариоты должны систематически конденсировать и уплотнять огромное количество генетической информации в минуту 3D пространство ядра1,2,3,4. Сегодня мы знаем, что геном пространственно упорядочен в отсеках и топологически связанных областях5 и что несколько уровней сворачивания ДНК генерируют контакты между различными геномными регионами, которые могут включать образование хроматиновых циклов6,7. 3D динамическая петля хроматина может влиять на многие различные биологические процессы, такие как транскрипция8,9,дифференциация и развитие10,11,репарация ДНК12,13, в то время как его возмущения участвуют в различных заболеваниях14,15,16 и дефекты развития15,17,18.
Для изучения организации 3D генома было разработано множество подходов. Хромосомы конформации захвата на основе технологий (C-технологии, 3C, 4C, 5C, Hi-C и производных) были разработаны для изучения организации генома в фиксированных клетках3,4,19,20. Такие подходы основаны на способности захватывать контактные частоты между геномными локусами в физической близости. C-технологии, в зависимости от их сложности, ловят глобальную организацию 3D генома и ядерную топологию популяции клеток3,4,19,20. Тем не менее, 3D взаимодействия являются динамическими во времени и пространстве, весьма изменчивы между отдельными клетками, состоящими из мультиплексных взаимодействий, и широко неоднородны21,22.
3D многоцветная флуоресценция ДНК на месте гибридизации (FISH) является методом, который позволяет визуализации конкретных геномных локусов на уровне одной клетки, что позволяет прямое исследование 3D ядерной архитектуры в дополнение к C-технологий. Он представляет собой технологию, используемую в настоящее время для однозначной проверки C-результатов. 3D многоцветная ДНК FISH использует флуоресцентно маркированные зонды, дополняющие геномные локусовы интересов. Использование различных фторофоров и подходящего микроскопионного оборудования позволяет современную визуализацию нескольких целей в ядерном пространстве23,24. В последние годы FISH был объединен с технологическими достижениями в микроскопии, чтобы получить визуализацию мелкомасштабных структур с высоким разрешением25,26 или с CRISPR-Cas подходы для визуализации нуклеиновых кислот в живой визуализации27,28. Несмотря на широкое внедрение, 3D многоцветный подход DNA FISH по-прежнему считается сложным во многих лабораториях, поскольку используемый биологический материал должен быть адаптирован.
Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол для 3D многоцветной ДНК FISH (от подготовки клеток/зонда до анализа данных), применимый к широкому кругу первичных клеток человека, что позволяет визуализировать несколько геномных локусов и сохранять 3D-структуру ядер. Для изучения ядерной архитектуры необходимо сохранить трехдернскую структуру ядер. По этой причине, в отличие от других существующих протоколов29,30,31, мы избегаем использования градиента алкоголя и хранения крышки в спирте, которые могут повлиять на структуру хроматина32. Метод адаптирован из сохранившихся 3D-протоколов ДНК FISH24,33, которые будут применяться к широкому кругу первичных клеток человека, как изолированных ex vivo, так и культивируемых in vitro. Существуют параметры пермяки и депротеинации для различных ядерных морфологии и цитологических характеристик (например, разной степени ядерного уплотнения, цитоскелет изобилие)34. Эти параметры часто обычно описаны в других протоколах24,33, без предоставления четкой дискриминации процедуры в различных типах клеток. Кроме того, мы разработали специальный инструмент под названием NuCL’D (ядерный локатор контактов в 3D)16, обеспечивая принципы анализа данных, которые улучшат 3D близость между различными локусами и их ядерное топологическое распределение в ядерном пространстве в автоматизированном режиме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий метод описывает пошагу протокол для выполнения 3D многоцветной ДНК FISH на широком диапазоне первичных клеток человека. Хотя ДНК FISH является технологией широкого использования, 3D многоцветная ДНК FISH на сохранившихся 3D межфазных ядрах по-прежнему трудно выполнить во многих лабор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают техническую помощь INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Ромео эд Энрика Инверници” (INGM), Милан, Италия), в частности C. Cordiglieri, за помощь в 3D многоцветных изображений ДНК FISH Приобретение. Эта работа была поддержана следующими грантами Для B.B.: EPIGEN Итальянский флагман программы, Ассоциация Франсез contre les Myopathies (AFM-Telethon, грант nr 18754) и Джовани Ricercatori, Министерство здравоохранения Италии (GR-2011-02349383). Эта работа была поддержана следующим грантом Ф.М.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, грант nr 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
