3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים
Summary
3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.
Abstract
השאלה העיקרית בביולוגיה התא הוא ארגון גנומית בתוך החלל הגרעיני וכיצד אדריכלות כרומטין יכול להשפיע על תהליכים כגון ביטוי גנים, זהות תא ובידול. גישות רבות שפותחו כדי ללמוד את ארכיטקטורת 3D של הגנום ניתן לחלק לשתי קטגוריות משלימות: לכידת כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידה (C-טכנולוגיות) והדמיה. בעוד הראשון מבוסס על לכידת קונפורמציה כרומוזום ואינטראקציות DNA האבובית באוכלוסייה של תאים קבועים, האחרון, מבוסס על הזריחה DNA באתרו היברידיזציה (דג) על גרעיני תלת-ממד, מאפשר הדמיה עכשווית של הילה מרובים ברמת תא בודד (ססגוניות), בחינת האינטראקציות שלהם והפצה בתוך הגרעין (3d דג DNA מרובה צבעים). הטכניקה של 3D דג ה-DNA מרובת צבעים יש מגבלה של המחשה רק כמה מראש מראש, לא מאפשר ניתוח מקיף של האדריכלות הגרעינית. עם זאת, בהינתן את החוסן של תוצאותיה, 3D מרובת צבעים דג DNA בשילוב עם 3D-מיקרוסקופיה ושחזור תמונה היא שיטה אפשרית כדי לאמת את התוצאות C-טכנולוגיה מבוססת לחקור באופן משמעי את המיקום והארגון של המקום המסוים ברמת תא בודדת. כאן, אנו מציעים צעד אחר צעד שיטה של 3D מרובת צבעים דג DNA מתאים למגוון רחב של תאים הראשי האדם ולדון בכל הפעולות המעשיות, צעדים מכריעים, מושגים של 3D הדמיה וניתוח נתונים הדרושים כדי להשיג מוצלח אינפורמטיבי 3D תלת-צבעי דגי דנ א בתוך הקשרים ביולוגיים שונים.
Introduction
Eukaryotes גבוה יותר צריך לדחוס באופן שיטתי וקומפקטי כמות עצומה של מידע גנטי ברגע 3d החלל של הגרעין1,2,3,4. היום, אנו יודעים כי הגנום הוא מרחב הורה בתאים ותחומים הקשורים טופולוגית5 וכי רמות מרובות של קיפול DNA ליצור קשרים בין אזורים גנומית שונים שעשויים לכלול לולאה כרומטין היווצרות6,7. הלולאה הדינמית 3d של כרומטין יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים שונים כגון שעתוק8,9, בידול ופיתוח10,11, DNA תיקון12,13, בעוד רטבאליות שלה מעורבים במחלות שונות14,15,16 ופגמים התפתחותיים15,17,18.
גישות רבות פותחו כדי ללמוד את ארגון הגנום 3D. היווצרות כרומוזום טכנולוגיות מבוססות לכידת (C-טכנולוגיות, 3c, 4c, 5c, היי-C ונגזרים) פותחו כדי ללמוד ארגון הגנום בתאים קבועים3,4,19,20. גישות כאלה מבוססות על היכולת ללכוד את תדרי המגע בין הרוח גנומית בסמיכות פיזית. C-טכנולוגיות, בהתאם למורכבות שלהם, לתפוס את הארגון הגלובלי 3d הגנום וטופולוגיה גרעינית של אוכלוסייה תא3,4,19,20. עם זאת, אינטראקציות תלת מימד הן דינמיות בזמן ובמרחב, משתנה מאוד בין תאים בודדים המורכב מאינטראקציות של מולטיפלקס, והן הטרודוגני בהרחבה21,22.
3D מרובה הקרינה הפלואורסצנטית DNA באתרו היברידיזציה (דג) היא טכניקה המאפשרת ויזואליזציה של גנומית ספציפיים ברמת תא בודד, המאפשר חקירה ישירה של האדריכלות הגרעינית 3D בצורה משלימה C-טכנולוגיות. היא מייצגת טכנולוגיה המשמשת כיום לאימות בלתי משמעי של תוצאות C. 3D-DNA דגים מרובי צבעים משתמש בדיקות באמצעות פלואורוסקופים המשלימים את הרוח גנומית של אינטרסים. השימוש fluorophores שונים וציוד מיקרוסקופ מתאים לאפשר הדמיה עכשווית של מטרות מרובות בתוך החלל הגרעיני23,24. בשנים האחרונות, הדגים שולבו עם פיתוחים טכנולוגיים במיקרוסקופיה כדי להשיג את ההדמיה של מבנים בקנה מידה משובח ברזולוציה גבוהה25,26 או עם הגישות crispr-Cas עבור ההדמיה של חומצות גרעין ב הדמיה חיה27,28. למרות אימוץ רחב, 3D מרובת צבעים הגישה דג DNA הוא עדיין נחשב קשה במעבדות רבות כי החומר הביולוגי המשמש חייב להיות מותאם.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף עבור 3D דג ה-DNA דגים (מתא/בדיקה הכנה לניתוח נתונים) החלים על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, המאפשר ויזואליזציה של גנומית מרובים ושמירה על מבנה 3D של גרעינים. כדי ללמוד אדריכלות גרעינית, המבנה התלת-ממדי של גרעיני חייב להישמר. מסיבה זו, מנוגד פרוטוקולים קיימים אחרים29,30,31, אנו נמנעים מהשימוש במעבר אלכוהול ואחסון של שמיכות באלכוהול שיכולים להשפיע על מבנה כרומתין32. השיטה מותאמת מפני שנשמרו 3d DNA הפרוטוקולים דגים24,33 להיות מוחל על מגוון רחב של תאים ראשוניים אנושיים, הן מבודדות לשעבר vivo או תרבותי בתחום החוץ. יש החדירות ואת הפרמטרים הדפרוטמולוגיה עבור המאפיינים הגרעיניים שונים ומאפיינים ציטולוגיים (למשל, דרגות שונות של דחיסה גרעינית, שפע השלד ציטומה)34. פרמטרים אלה מתוארים בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים24,33, מבלי לספק אפליה ברורה של ההליך בתוך סוגי תאים שונים. יתר על כן, פיתחנו כלי ספציפי בשם NuCLεD (מאתר הקשר הגרעיני ב 3D)16, מתן עקרונות לניתוח נתונים שישפרו את הקירבה 3d בין המקום האחר ואת התפלגות טופולוגית הגרעינית שלהם בתוך החלל הגרעיני באופן אוטומטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה הנוכחית מתארת את הפרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע דג DNA תלת-צבעי תלת-ממדי על מגוון רחב של תאים ראשיים אנושיים. למרות שדגי ה-dna הוא טכנולוגיה בשימוש רחב, 3d דג ה-dna דגים על שנשמרו גרעיני interphase תלת-ממד עדיין קשה לבצע במעבדות רבות, בעיקר בשל המאפיינים של דגימות בשימוש23,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בסיוע הטכני של מתקן הדימות INGM (המכון הפוליטכני של המרכז הטכנולוגי “רומיאו אד אנריקה” (INGM), מילאנו, איטליה), במיוחד C. Cordiglieri, לקבלת סיוע במהלך 3D תמונות דג DNA מרובת צבעים רכישת. עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים כדי לבי: התוכנית הדגל האיטלקי epigen, האגודה הצרפתית דשנה Myopathies (afm-שידור, גרנט nr 18754) ו ג’ובאני ricercatori, משרד הבריאות האיטלקי (GR-2011-02349383). עבודה זו נתמכת על ידי המענק הבא פ: Fondazione קאריפלו (באנדו ג’ובאני, גרנט nr 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
