3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

Les eucaryotes plus élevés doivent condenser et compacter systématiquement une énorme quantité d’informations génétiques dans l’espace 3D minute du noyau^1,2,3^,4. Aujourd’hui, nous savons que le génome est classé spatialement dans des compartiments et des domaines topologiquement associés⁵ et que les niveaux multiples de pliage de l’ADN génèrent des contacts entre différentes régions génomiques qui peuvent impliquer la formation de boucle de chromatine^6,7. La boucle dynamique 3D de la chromatine peut influencer de nombreux processus biologiques différents tels que la transcription^8,9, la différenciation et le développement^10,11, réparation de l’ADN^12,13, tandis que ses perturbations sont impliqués dans diverses maladies^14,15,16 et les défauts de développement^15,17,18.

De nombreuses approches ont été développées pour étudier l’organisation du génome 3D. Des technologies basées sur le capture de conformation de chromosome (C-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C et dérivés) ont été développées pour étudier l’organisation de génome dans les cellules fixes^3,4,19,20. Ces approches sont basées sur la capacité de capturer les fréquences de contact entre les loci génomiques à proximité physique. C-technologies, en fonction de leur complexité, attraper l’organisation mondiale du génome 3D et la topologie nucléaire d’une population cellulaire^3,4,19,20. Néanmoins, les interactions 3D sont dynamiques dans le temps et l’espace, très variables entre les cellules individuelles composées d’interactions multiplexes, et sont largement hétérogènes^21,22.

L’hybridation 3D de fluorescence in situ de l’ADN multicolore (FISH) est une technique qui permet la visualisation de loci génomiques spécifiques à un seul niveau de cellule, permettant une étude directe de l’architecture nucléaire 3D d’une manière complémentaire aux technologies C. Il représente une technologie actuellement utilisée pour valider sans ambiguïté les résultats C. 3D multicolor DNA FISH utilise des sondes étiquetées fluorescentes complémentaires aux loci génomiques d’intérêts. L’utilisation de différents fluorophores et d’équipements de microscopie appropriés permet la visualisation contemporaine de cibles multiples dans l’espace nucléaire^23,24. Ces dernières années, FISH a été combiné avec les progrès technologiques dans la microscopie pour obtenir la visualisation des structures à échelle fine à haute résolution^25,26 ou avec des approches CRISPR-Cas pour la visualisation des acides nucléiques en imagerie en direct^27,28. Malgré une large adoption, l’approche 3D multicolor DNA FISH est encore considérée comme difficile dans de nombreux laboratoires car le matériel biologique utilisé doit être adapté.

Ici, nous fournissons un protocole complet pour 3D multicolor DNA FISH (de la préparation cellulaire / sonde à l’analyse des données) applicable à un large éventail de cellules primaires humaines, permettant la visualisation de loci génomiques multiples et la préservation de la structure 3D des noyaux. Afin d’étudier l’architecture nucléaire, la structure 3D des noyaux doit être préservée. Pour cette raison, contrairement à d’autres protocoles existants^29,30,31, nous évitons l’utilisation d’un gradient d’alcool et le stockage des couvertures dans l’alcool qui peut affecter la structure de chromatine³². La méthode est adaptée à partir de protocoles FISH d’ADN 3D conservés^24,33 à appliquer à un large éventail de cellules primaires humaines, à la fois isolées ex vivo ou cultivées in vitro. Il existe des paramètres de perméabilisation et de déprotéinisation pour différentes morphologies nucléaires et caractéristiques cytologiques (p. ex., différents degrés de compactage nucléaire, abondance de cytosquelettes)³⁴. Ces paramètres sont souvent généralement décrits dans d’autres protocoles^24,33, sans fournir une discrimination claire de la procédure au sein de différents types de cellules. En outre, nous avons développé un outil spécifique nommé NuCLD (localisateur de contacts nucléaires en 3D)¹⁶, fournissant des principes pour l’analyse des données qui permettra d’améliorer la proximité 3D entre les différents loci et leur distribution topologique nucléaire dans l’espace nucléaire d’une manière automatisée.