Количественная оценка металлоизмов в иммобилизованной хроматографии сродства металла

С момента своего создания Порат и коллег¹, обездвиженный хроматографии сродства металла (IMAC) стал методом выбора, чтобы быстро отделить белки на основе их способности связываться с переходными ионами металла, такими как «n^2», Ni^{2 ,}Cu^{2 »,}и Co^{2 .} Это чаще всего делается с помощью инженерии поли-гистидин теги и в настоящее время является одним из наиболее распространенных методов хроматографической очистки для изоляции рекомбинантных белков². IMAC также нашел применения за рекомбинантных белков очистки как способ изолировать хинолоны, тетрациклины, аминогликозиды, макролиды, и лактамы для анализа образца пищи³ и в качестве шага в выявлении маркеров белка сыворотки крови для печени и рака поджелудочной^{железы4.} Неудивительно, что IMAC также стал методом выбора для изоляции ряда местных ферментов биоэнергетики^6,7,8,9,10. Однако успешная реализация этих методов очистки для исследований на ферментативно активных биоэнергетических белках зависит от наличия незначительного уровня металлических катионов, выщелачиваемых из колонки матрицы в элюат. Divalent металлические катионы, широко используемые в IMAC, имеют известное патологическое биологическое значение, даже при низких концентрациях^11,12. Физиологический эффект этих металлов наиболее выражен в биоэнергетических системах, где они могут оказаться смертельными в качестве ингибиторов клеточного дыхания или фотосинтеза^13,14,15. Подобные проблемы неизбежны для большинства белковых классов, где остаточные загрязняющие металлы могут вмешиваться в биологические функции белка или характеристики с биохимическими и биофизическими методами.

В то время как уровни загрязнения металла в условиях окисления и использования имидазола в качестве элуанта, как правило,низкие¹⁶, белковые изоляции выполняются в присутствии цистеина снижения агентов (DTT, й-меркаптоэтанол и т.д.) или с сильными хелаторами, как гистидин^17,18 или этилэнедиаминироватьететраацетической кислоты (EDTA) привести к гораздо выше . Аналогичным образом, поскольку ионы металла в ясных ясниках Часто координируются карбоксильными группами, эмуции белка, выполняемые в кислых условиях, также могут иметь гораздо более высокие уровни загрязнения металла. Содержание металла в растворах можно оценить с помощью атомной спектроскопии поглощения (ААС) и индуктивно соединенных плазменно-массовой спектрометрии (ICP-MS) до предела обнаружения в диапазоне ppb-ppt^21,22,23,24. К сожалению, ААС и МСП-МС не являются реальнымсредством для обнаружения в традиционной лаборатории биохимии, поскольку эти методы потребуют доступа к специализированному оборудованию и обучению.

Предыдущая работа Brittain^25,26 исследовалиспользование использование гидроксинафтола синего (HNB) как способ определить наличие переходных металлов в растворе. Однако в данных²⁰ было несколько внутренних противоречий, и эти работы не дали адекватного протокола. Исследования, проведенные Temel et al.²⁷ и Ferreira et al.^28, расширили работу Бриттена с HNB в качестве потенциального металлического индикатора. Тем не менее, Темель разработал протокол, который использует AAS для анализа выборки, используя HNB только в качестве хелатирующего агента. Изучение Ferreira использовало изменение в спектре абсорбции HNB на 563 nm, зоне спектра HNB свободного красителя HNB которое перекрывает тяжело с спектрами комплексов HNB-металла на pH 5.7, делая чувствительность анализа справедливо низка, также, как приводящ к в относительно слабом сродстве связывания металла^20. Для решения проблем в нашей собственной лаборатории с Выщелачивание Ni^{2 “от} IMAC, мы расширили работу, проделанную Brittain^25,26 и Ferreria²⁸ разработать простой анализ, способный обнаруживать наномолярные уровни нескольких переходных металлов. Мы показали, что HNB связывает никель и другие общие для IMAC металлы с субнаномоллярной связывания сродства и образуют 1:1 комплекс в широком диапазоне значений рН²⁰. Ассаи, представленный здесь, основан на этих выводах и использует абсорбционные изменения в спектре HNB на уровне 647 нм для количественной оценки металла. Анализ может быть выполнен в физиологическом диапазоне рН с использованием общих буферов и приборов, найденных в типичной лаборатории биохимии с помощью колориметрического обнаружения и количественной оценки металлоочистительных комплексов и связанных с этим изменений в абсорбции свободного красителя, когда он связывается с металлом.