Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de pseudomonas aeruginosa ferida
Summary
Descrevemos um protocolo de inoculação atrasado para gerar infecções crônicas de feridas em camundongos imunocompetentes.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é um grande patógeno nosocomial de crescente relevância para a saúde e doença humana, particularmente no cenário de infecções crônicas de feridas em pacientes diabéticos e hospitalizados. Há uma necessidade urgente de modelos de infecção crônica para auxiliar na investigação da patogênese ferida e no desenvolvimento de novas terapias contra esse patógeno. Aqui, descrevemos um protocolo que usa inoculação atrasada 24 horas após ferimentos excisional de espessura total. A infecção da matriz de feridas provisórias presente neste momento, ou a liberação rápida ou a disseminação da infecção e, em vez disso, estabelece infecção crônica que dura de 7 a 10 dias sem a necessidade de implantação de materiais estranhos ou supressão imunológica. Este protocolo imita um curso temporal típico de infecção pós-operatória em humanos. O uso de uma cepa luminescente P. aeruginosa (PAO1:lux) permite a avaliação diária quantitativa da carga bacteriana para infecções por feridas P. aeruginosa. Este novo modelo pode ser uma ferramenta útil na investigação da patogênese bacteriana e no desenvolvimento de novas terapias para infecções crônicas de feridas P. aeruginosa.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) é uma bactéria em forma de vara gram-negativa com crescente relevância para a saúde e doenças humanas. É responsável pela morbidade e mortalidade extensivas em ambientes nosocomiais, particularmente envolvendo infecções por feridas em pacientes imunocomprometidos1,2. O surgimento de cepas multidrogaresistentes deste patógeno proporcionou mais impulso para a investigação de fatores que contribuem para a virulência P. aeruginosa, mecanismos de resistência a antibióticos P. aeruginosa e novos métodos de prevenção e tratamento desta infecção mortal3. Como tal, a necessidade de modelos animais de infecção por feridas crônicas como ferramentas para investigar essas questões de pesquisa nunca foi tão grande.
Infelizmente, muitos modelos animais de infecção por P. aeruginosa tendem a simular infecção aguda com resolução rápida de infecção ou declínio rápido devido à sepse4,5, que não simula adequadamente a natureza frequentemente crônica dessas infecções. Para resolver essa desvantagem, alguns modelos utilizam a implantação de corpos estranhos, como contas de agar, implantes de silicone ou géis alginatos6,7,8. Outros modelos usam camundongos imunocomprometidos devido à idade avançada, obesidade ou diabetes, ou por meios farmacológicos como neutropenia induzida por ciclofosfhamide9,10,11,12. No entanto, ou o uso de materiais estranhos ou hospedeiros imunes comprometidos provavelmente altera o processo inflamatório local, dificultando a compreensão da fisiopatologia envolvida em infecções crônicas de feridas em hospedeiros com sistemas imunológicos normais.
Desenvolvemos um modelo crônico de infecção por ferida de P. aeruginosa em camundongos que envolve inoculação tardia com bactérias após ferimentos excisional. A inoculação retardada permite experimentos que avaliam a carga bacteriana que se estende por pelo menos 7 dias. Este modelo abre novas oportunidades para investigar tanto a patogênese quanto novos tratamentos de infecções crônicas p. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolvemos um novo modelo de infecção por feridas de inoculação tardia P. aeruginosa. A estratégia de retardar a inoculação com bactérias até 24 h após o ferimento excisional permite a avaliação de infecções por feridas durante um prazo de 1 semana. Usando uma cepa luminescente de P. aeruginosa,é possível rastrear a progressão da infecção ao longo do curso de infecção. O curso mais longo de infecção em comparação com outros modelos de infecção por P. aeruginosa per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O vetor de construção luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 foi um presente gracioso de J. Hardy. Os esquemas foram criados com BioRender.com. Agradecemos ao laboratório de G. Gurtner por seus conselhos sobre o modelo de infecção por feridas. Também agradecemos a T. Doyle, do Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging, por sua experiência técnica. Este trabalho foi apoiado por subsídios R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, e subsídios da Stanford SPARK, do Falk Medical Research Trust e da Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para p.L.B. C.R.D foi apoiado pela T32AI007502. Uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Gabilan Stanford e uma Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinar Graduate Fellowship apoiaram j.M.S.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection | Hospira | 2484457 | |
| 18 G x 1 sterile needle | BD | 305195 | |
| 25 G x 1 1/5 sterile needle | BD | 305127 | |
| Alcohol swab | BD | 326895 | |
| Aura Imaging Software | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| Betadine | Purdue Frederick Company | 19-065534 | |
| Buprenorphine SR LAB | Zoopharm | n/a | |
| C57BL/6J male mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Disposable biopsy punch, 6mm | Integra | 33-36 | |
| Fine scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Glass Bead Dry Sterilizer | Harvard Apparatus | 61-0183 | |
| Granulated Agar | Fisher BioReagents | BP9744 | |
| Heating Pad | Milliard | 804879481218 | |
| Insulin syringe with 28 G needle | BD | 329461 | |
| Lago X Imaging System | Spectral Instruments Imaging | n/a | |
| LB broth | Fisher BioReagents | BP1426 | |
| Leur-Lok 1 mL syringe | BD | 309628 | |
| Mini Arco Animal Trimmer | Wahl Professional | 919152 | |
| Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil | Church and Dwight | n/a | Available at any pharmacy |
| Octagon Forceps | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Press and Seal Cling Wrap | Glad | n/a | |
| SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle | BD | 305934 | |
| Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW | BD | 305934 | |
| Scale | Ohaus Scout Pro | SP202 | |
| Supplical Nutritional Supplement | Henry Schein Animal Health | 29908 | |
| Tegaderm, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Serra, R., et al. Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).
- Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options. Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).
- Secor, P. R., et al. Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo. Infection and Immunity. 85 (1), (2017).
- Rice, S. A., et al. The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage. The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).
- Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Scientific Reports. 6, 35838 (2016).
- van Gennip, M., et al. Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo. Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Zhao, G., et al. Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model. Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).
- Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age. Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).
- Sweere, J. M., et al. The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice. Advances in Wound Care. , (2019).
- Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science. 363 (6434), (2019).
