유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석
Summary
손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.
Abstract
뉴런은 그들의 기능을 지원 하기 위해 높은 에너지에 대 한 강렬한 요구. 축 세포를 따라 손상 된 미토 콘 드리 아 수송 인간의 신경에서 관찰 되었습니다., 다양 한 질병 상태에서 신경 변성에 기여할 수 있는. 살아있는 인간 신경에 있는 미토콘드리아 역학을 검토하는 것은 도전적이더라도, 그 같은 패러다임은 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 공부하기 를 위해 중요합니다. 여기서 기재된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 유래된 전뇌 뉴런 축에서 미토콘드리아 수송 및 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 프로토콜이다. iPSCs는 잘 확립된 방법을 사용하여 텔렌세팔산 글루탐생성 뉴런으로 분화됩니다. 뉴런의 미토콘드리아는 미토트래커 CMXRos로 염색되고, 축색내미토콘드리아 운동은 세포 배양을 위한 인큐베이터가 장착된 살아있는 세포 이미징 현미경을 사용하여 포획된다. 시간 경과 이미지는 “MultiKymograph”, “바이오 포맷 수입기”, “매크로”플러그인소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 미토콘드리아 수송의 척추 그래프가 생성되고, 전위 및 역행 방향의 평균 미토콘드리아 속도가 kymograph에서 읽습니다. 미토콘드리아 형태 분석에 관해서는, 미토콘드리아 길이, 면적 및 종횡비는 ImageJ를 사용하여 얻어진다. 요약하면,이 프로토콜은 축삭을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화및 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하기 위해 자신의 형태학의 분석을 할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아 운동성 및 분포는 편광 뉴런의 가변적이고 전문적인 에너지 요구를 충족시키는 데 중요한 역할을 합니다. 뉴런은 Ca2+ 버퍼링 및 이온 전류에 대한 높은 수준의 에너지를 요구하는 시냅스의 형성을 통해 표적과 연결하기 위해 매우 긴 축세포를 확장할 수 있습니다. 소마에서 축종으로미토콘드리아를 운반하는 것은 뉴런의 축축및 시냅스 기능을 지원하는 데 매우 중요합니다. 공간적 및 시간적으로 동적 미토콘드리아 운동은 초당 수 마이크로미터의 속도로 빠른 축색 수송에 의해 수행됩니다1.
구체적으로, 운동 또는 어댑터 단백질, 예컨대 키네신 및 다인, 미토콘드리아2,3의움직임을 조절하기 위해 마이크로소튜플을 따라 빠른 소기관 수송에 참여한다. 정상적인 신경 활동은 뉴런 소마에서 말단 축종 (전방 축색 수송)으로 새로 조립 된 미토콘드리아의 적절한 수송을 필요로하고 원위 축사에서 다시 세포체로 미토콘드리아의 역수송 (역행 수송). 최근 연구에 따르면 부적절한 미토콘드리아 할당은 신경 성 결함 및 운동 신경 퇴행성 질환4,5와강하게 연관되어 있음을 나타냈다. 따라서, 신경 변성에서 미토콘드리아의 역할을 해부하기 위해, 살아있는 문화에서 축색을 따라 미토콘드리아 운동을 검사하는 방법을 확립하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아의 추적을 검사하고 분석하는 데는 두 가지 주요 과제가 있습니다: (1) 모든 프레임의 배경에서 미토콘드리아를 식별하고, (2) 모든 프레임 간의 연결을 분석하고 생성합니다. 제1 과제를 해결하기 위해, 형광 표지 접근법은 미토콘드리아염 또는 형광 융합 미토콘드리아 표적단백질(예를 들어, 미토콘드리아 표적화 단백질)의 형광-융합 미토콘드리아 표적화 단백질(예를 들어, 미토-GFP)의 백질과 같은 배경으로부터 미토콘드리아를 구별하기 위해 널리 사용된다(예를 들어, 미토콘드리아 표적화)6,7,8. 프레임 간의 연관성을 분석하기 위해 이전 연구9에서여러 알고리즘 및 소프트웨어 도구가 설명되었습니다. 최근 논문에서 연구원들은 4개의 다른 자동화 도구(예: Volocity, Imaris, wrMTrck 및 차이 추적기)를 비교하여 미토콘드리아 수송을 정량화했습니다. 결과는 트랙 길이, 미토콘드리아 변위, 이동 지속 시간 및 속도의 불일치에도 불구하고, 이러한 자동화된 도구는 치료 후 수송 차이를 평가하기에 적합하다는 것을 보여주었다10. 이러한 도구 외에도 ImageJ용 통합 플러그인 “매크로”(Rietdorf 및 Seitz가 작성)는 미토콘드리아전송(11)을분석하는 데 널리 사용되어 왔다. 이 방법은 미토콘드리아 운동을 분석하는 데 사용할 수있는 척추 그래프를 생성, 전위 및 역행 방향 모두에서 속도를 포함.
미토콘드리아는 생리적 및 병리학적 조건에 반응하여 수와 형태학이 끊임없이 변화하는 매우 역동적인 세포기관입니다. 미토콘드리아 분열과 융합은 미토콘드리아 형태와 항상성을 엄격하게 조절합니다. 미토콘드리아 핵분열과 융합 사이의 불균형은 미토콘드리아 기능을 손상시키고 비정상적인 신경 활동과 신경 변성을 초래할 수 있는 매우 짧거나 긴 미토콘드리아 네트워크를 유도할 수 있습니다. 미토콘드리아 수송 및 형태학 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 유전적 경련 하반신마비(HSP)12,13,14,15와 같은 다양한 신경퇴행성 질환에 관여한다. HSP는 코르티코척추의 변성 및 하반신 근육을 조절하는 후속 실패를 특징으로 하는 상속된 신경 장애의 이질적인그룹(16,17)이다. 이 연구에서는, iPSC 파생 된 전뇌 뉴런은 HSP에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 살아있는 문화에서 뉴런 축색의 미토콘드리아 역학을 검사하기위한 독특한 패러다임을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 적색 형광 염료 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 뉴런 축색의 미토콘드리아 수송 및 형태를 분석하는 방법을 설명하며, 둘 다 신경 퇴행성 질환에서 축사 변성 및 미토콘드리아 형태를 연구하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 프로토콜에는 미토콘드리아의 염색, 살아있는 세포 화상 진찰 및 심상 분석을 포함하여 몇몇 중요한 단계가 있습니다. 이 방법에서는, 형광 염료를 미토콘드?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 경련 하반신 마비 재단, 블레이저 재단과 NIH (R21NS109837)에 의해 지원되었다.
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. 화학. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
