Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Ramona  A. Kopton; Cinthia Buchmann; Robin Moss; Peter Kohl; R&#233;mi Peyronnet; Franziska Schneider-Warme

doi:10.3791/60490

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

의학

Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

Published: March 05, 2020

doi:

10.3791/60490

Ramona A. Kopton^1,2,3, Cinthia Buchmann^1,2, Robin Moss^1,2, Peter Kohl^1,2, Rémi Peyronnet^1,2, Franziska Schneider-Warme^1,2

¹Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, University Heart Center Freiburg-Bad Krozingen,Medical Center-University of Freiburg, ²Faculty of Medicine,University of Freiburg, ³Faculty of Biology,University of Freiburg

Summary

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Abstract

Son yirmi yılda, optogenetik araçlar, kalp de dahil olmak üzere, heyecanlı dokularda hücre tipi spesifik aktiviteyi modüle etmek için güçlü bir araç olarak kurulmuştur. Channelrhodopsin-2 (ChR2) kardiyomiyositlerde (CM) membran potansiyelini depolarize etmek için yaygın bir araç iken, potansiyel olarak etki potansiyellerini ortaya çıkarmak (AP), CM aktivitesinin güvenilir susturulması için etkili bir araç eksik olmuştur. Optogenetik inhibisyon için aniyon kanalrhodopsin (ACR) kullanılması önerilmiştir. Burada, guillardia tetadan gelen doğal ACR GtACR1’in kültürlü tavşan CM’sinde aktive edilmesinin etkilerini değerlendirmek için bir protokol uyguluyoruz. Protokol, tavşan kalbinden CM izolasyonu, 4 güne kadar hücrelerin tohumlanması ve kültürünü, ışık kapılı klorür kanalı için adenovirüs kodlaması yoluyla transdüksiyonu, yama-kelepçe ve karbon fiber kurulumlarının hazırlanmasını, veri toplamayı ve analizini içerir. Tüm hücre yapılandırmasında yama kelepçesi tekniğinin kullanılması, ışıkla aktive edilmiş akımların (voltaj-kelepçe modunda, V-kelepçe modunda) ve AP’nin (akım-kelepçe modu, I-kelepçe) gerçek zamanlı olarak kaydedilmesine olanak tanır. Yama-kıskaç deneylerine ek olarak, hücre içi ortamı bozmadan CM aktivitesinin fonksiyonel değerlendirilmesi için kontraktilite ölçümleri gerçekleştiriyoruz. Bunu yapmak için, hücreler mekanik karbon lifleri kullanılarak önceden yüklenir ve kasılmalar sarcomere uzunluğu ve karbon fiber mesafesi değişiklikleri izleyerek kaydedilir. Veri analizi, I-kıskaç kayıtlarından AP süresinin, V-kelepçe kayıtlarından en yüksek akımların ve karbon fiber ölçümlerinden kuvvet hesaplamasının değerlendirilmesini içerir. Açıklanan protokol, kardiyak doku ve tüm kalplerde optogenetik deneylerin mekanistik bir anlayışının geliştirilmesi için bir ön koşul olan CM aktivitesi üzerine farklı optogenetik aktüatörlerin biyofiziksel etkilerinin test edilmesine uygulanabilir.

Introduction

CH-aracılı fotoakımlar ilk tek hücreli yeşil alg lerin göz bölgesinde kaydedildi¹^,². Chlamydomonas reinhardtii ChR1 ve ChR2’nin genetik klonlama ve heterolog ekspresyonundan kısa bir süre sonra, ChR Xenopus oositleri ve memeli hücrelerinde membran potansiyelini ışıkla değiştirmek için araç olarak kullanılmıştır³^,⁴. Katyon non-selektif ChR ChR ters potansiyeline negatif bir dinlenme membran potansiyeli ile hücrelerin membran depolarize. Bu nedenle, nöronlar ve CM dahil olmak üzere, optik pacing⁵^,⁶sağlayan, uyarılabilir hücrelerde AP ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Katyon ChR tamamlayıcı, ışık tahrikli proton, klorür ve sodyum pompaları⁷^,⁸^,⁹ nöronal aktiviteyi inhibe etmek için kullanılmıştır¹⁰^,¹¹^,¹². Ancak, ikincisi sınırlamalar var, yüksek ışık yoğunlukları ve sürekli aydınlatma gerektiren, bir iyon emilen foton başına taşınır gibi. 2014 yılında, Wietek ve ark. ve Berndt ve ark. tarafından yapılan iki bağımsız çalışmada, katyon iletken ChR’nin kanal gözenek¹³^,^14’tekimutasyonlar yoluyla ACR’ye dönüştürülmesi açıklanmıştır. Bir yıl sonra, doğal ACR cryptophyte Guillardia theta keşfedildi (GtACR)¹⁵. Mühendislik ACR artık katyon iletkenlik gösterdi, onlar doğal ACR ile değiştirildi, büyük bir tek kanallı iletkenlik ve yüksek ışık hassasiyeti ile karakterize¹⁵. GtACR klorür¹⁶ters potansiyele karşı membran potansiyelini polarize ederek nöronal aktiviteyi susturmak için kullanılmıştır¹⁷^. Govorunova ve ark. kültürlü sıçan ventriküler CM GtACR1 uygulanan ve proton pompası Arch¹⁸gibi daha önce mevcut inhibisyon araçları etkinleştirmek için yeterli değildi düşük ışık yoğunluğu düzeylerinde verimli fotoinhibisyon gösterdi. Grubumuz son zamanlarda CM GtACR1 aracılı fotoinhibisyon depolarizasyon dayalı olduğunu bildirdi ve GtACR1 de kullanılabilir, bu nedenle, CM optik pacing için¹⁹.

Burada GtACR1 fotoaktivasyonunun kültürlü tavşan ventrikül CM’si üzerindeki elektrofizyolojik ve mekanik etkilerini incelemek için bir protokol sürün. Önce hücre izolasyonu, culturing ve transdüksiyonu tanımlıyoruz. Elektrofizyolojik etkiler tüm hücreli yama-kıskaç kayıtları kullanılarak ölçülür. Belirli bir membran gerilimindeki ışık aracılı akımlar V-kelepçe modunda değerlendirilir. Membran potansiyel dinamiği elektriksel veya optik pacing CM (I-kelepçe modu) sırasında ölçülür. Elektriksel olarak tetiklenen AP optik inhibisyonu sürekli ışık uygulaması kullanılarak test edilir. Mekanik etkiler sarcomere uzunluğunun görüntüleme tabanlı takibi ile birlikte karbon lifleri kullanılarak ölçülür. Bunu yapmak için, optik olarak kademeli hücreler, zıt hücre uçlarının yakınındaki plazma zarına iki karbon fiber takılarak mekanik olarak önceden yüklenir. Sarcomere uzunluk değişiklikleri optik veya elektriksel pacing sırasında kaydedilir. Son olarak, fotoinhibisyon hücrelerin elektriksel alan stimülasyonu sırasında ölçülür ve oluşturulan kuvvetler analiz edilir.

Protokol Şekil 1’dekiakış şemasında gösterilen aşağıdaki adımları içermektedir: tavşan derin anestezisi, tiopental aşırı doz enjeksiyonu, kalp eksizyonu, Langendorff perfüzyonu ve doku sindirimi, hücrelerin serbest bırakılması için dokunun mekanik ayrışması, CM veriminin mikroskobik analizi, CM’nin culturing’i, adenovirüs tip 5 ile transdüksiyon, kuluçka ve fonksiyonel deneyler takip eder.

Şekil 1: Elektriksel ve optik olarak kademeli CM elde etmek için kullanılan protokolün akış şeması. Kalpler 9-10 haftalık tavşanlardan çıkarılır ve langendorff kurulumu kullanılarak perfüzyon yapılırken kardiyak doku sindirilir. Hücreler mekanik ajitasyon ile serbest bırakılır. CM verimi mikroskop altında sayılır. CM kültürlüdür, adenovirüs tip 5 ile transdüktördür ve transdüksiyon sonrası 48-72 saat fonksiyonel deneyler yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Tüm tavşan deneyleri, Bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması na ilişkin Avrupa Parlamentosu’nun 2010/63/AB direktifinde belirtilen yönergelere göre gerçekleştirilmiştir ve Baden-Württemberg’deki yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Almanya). 1. Hücre yalıtımı için çözümler Aşağıdaki gereksinimlerin suyu ile hücre izolasyonu için çözümler hazırlayın(Tablo 1) ve Tablo 2’delistelenen iyonik bileşimlere göre .NOT: 1 M stok çözeltisinden CaCl2 ve MgCl2 eklenir. Su gereksinimleri İletkenlik [μS/cm] 25 °C’de 0.055 Pyrogen [AB/mL] > 0,001 Parçacık (boyut > 0,22 μm) [1/mL] ≤ 1 Toplam organik karbon [ppb] > 5 Mikroorganizmalar [CFU/mL] ≤ 1 RNase [ng/mL] > 0,01 DNase [ng/mL] > 4 Tablo 1: Su gereksinimleri. Fizyolojik tuzlu çözelti (1) Düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi (2) Enzim çözeltisi (3) Çözüm engelleme NaCl [mM] 137 137 137 137 KCl [mM] 4 14 14 14 HEPES [mM] 10 10 10 10 Kreatin [mM] 10 10 10 10 Taurin [mM] 20 20 20 20 Glikoz [mM] 10 10 10 10 MgCl2 [mM] 1 1 1 1 Adenozin [mM] 5 5 5 5 L-Karnitin [mM] 2 2 2 2 CaCl2 [mM] 1 – 0.1 0.1 Na-Heparin [IU/L] 5000 – – – EGTA [mM] – 0.096 Kollajenaz tip 2, 315 U/mg [g/L] – – 0.6 – Proteaz XIV [g/L] – – 0.03 – Sığır serum albumin [%] – – – 0.5 Ozmolarite [mOsmol/L] 325 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 Tablo 2: CM yalıtımı için çözümler. Tüm çözümleri 37 °C’de pH 7.4’e ayarlayın ve ozolaritiyi kontrol edin.NOT: Kalp eksizyonu ndan hemen önce enzimleri (Kollajenaz tip 2 ve Protaz XIV) çözün. Kullanmadan önce tüm çözeltilere oksijen verin. 2. Langendorff-perfüzyon kurulumuhazırlanması NOT: Kullanılan kurulum özel yapımdır. Şekil 2’dede belirtildiği gibi, kurulum üç su ceketli rezervuar (1-3), bir spiral karşı akım ısı eşanjörü (4) ve su ceketli perfüzyon kabından (5) oluşmaktadır. Şekil 2: Tavşan hücresi izolasyonu için optimize edilmiş Langendorff perfüzyon kurulumu. (1-3) (1) fizyolojik tuzlu solüsyon, (2) düşük kalsiyum, yüksek potasyum solüsyonu ve (3) enzim içeren kardiyoplejik solüsyon lu su kaplı rezervuarlar. (4) Spiral karşı akışlı ısı eşanjörü ve (5) su ceketli toplama tankı. Su ceketli sistemin girişi spiral ısı değiştiricidir (ısı eşanjörünün sonunda perfüzyon kanülünü bırakan çözeltilerin sıcaklığı 37 °C’de sabit olmalıdır), ardından perfüzyon kabı ve üç rezervuar dır. Tüm çözeltiler oksijenli (kesik çizgi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Isı değişim sisteminde 38 °C’de su sirkülasyonu yapmak için su banyosunun pompasını açın ve tüm çözümleri 37 °C’ye önceden ısıtın.NOT: (4) çıkışındaki sıcaklık 37 °C’de kontrol edilmeli ve sabit olmalıdır. Üç rezervuarı ilgili çözeltiyle doldurun ve her satırı (siyah) ilgili çözeltiyle yıkayın. Çözeltiyi kullanarak hava kabarcıkları olmadan sonundaki ana (mavi) çizgiyi doldurun (1).NOT: Çözeltileri önce (10 dk) ve kullanım sırasında oksijene verin. Rezervuar (3) musluk düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi ile hattı doldurun. Kanülde aort etrafında kalp bağlamak için bir dikiş hazırlayın. 3. Hücre izolasyonu Aşağıdaki şırıngaları hazırlayın. Sedasyon/anestezi için: 0.5 mL/kg vücut ağırlığı esketamine hidroklorür (25 mg/mL) ve 0.2 mL/kg vücut ağırlığı ksilazin hidroklorür (%2) karıştırın. İki şırıngayı 12 mL NaCl çözeltisi (%0,9) ile doldurun. 12.5 mg/mL Na-tiopental 6 mL hazırlayın, %0.9 NaCl çözeltisi içinde çözünmüş. 0,2 mL esketamin hidroklorür (25 mg/mL) şırınga doldurun. 0,2 mL Na-heparin (5,000 IU/mL) 1 mL 0,9 NaCl çözeltisi (son konsantrasyon 1.000 IU/mL) seyreltin. Sedate / anestezi tavşan (9-10 hafta, Yeni Zelanda beyaz tavşan, kadın veya erkek, ~ 2 kg) esketamin hidroklorür ve ksilazin hidroklorür intramüsküler enjeksiyon yoluyla (adım 3.1.1).NOT: Tavşanların tamamen uyuşturulması için en az 10 dk gerekir; tam süresi vücut ağırlığına bağlıdır. Anesteziyi sağ refleksinin kaybıyla doğrulayın. Damarların bulunduğu yeri göğüs ve kulakları tıraş edin. Kulak damarına esnek bir kanül yerleştirin, bantla düzeltin ve %0,9 NaCl çözeltisi ile temizleyin. 1 mL Na-heparin çözeltisini intravenöz olarak enjekte edin ve %0,9 NaCl çözeltisi ile temize çıkarın. 0,2 mL esketamin hidroklorür enjekte edin, %0,9 NaCl çözeltisi ile tekrar temize atın ve apneye kadar Na-tiopental enjekte edin.NOT: Tavşan pedal çekme refleksine yanıt vermemelidir. Sol taraftaki göğsü açın ve perikard’ı çıkarın. Kalp eksire olduğunda zamanlayıcıbaşlatın ve fizyolojik tuzlu çözeltide kalbi iki kez yıkayın.NOT: Kardiyak dokuda kazara hasar oluşmasını önlemek için yuvarlak uçlu makas kullanın. Fizyolojik tuzlu çözelti ile bir banyoda aort kanüle ve çözelti tüm doku tutmak. Langendorff perfüzyon sistemini (fizyolojik tuzlu çözelti (1), hız 24 mL/dk) açın. Kalbi Langendorff-perfüzyon kurulumuna aktarın, aortu perfusate nozula bağlayın ve kalbi aort çevresindeki dikişle kanüle (< 1 dk) sıkıca bağlayın.NOT: Kanüliyi fizyolojik tuzlu çözeltiile önceden doldurun, kanülasyon alanından Langendorff kurulumuna taşıma sırasında kanüle hava kabarcıklarının girmemesini sağlayın, kabarcıksız bağlayın. Tüm kan yıkanana kadar kalbi perfuse (2-3 dk). Düşük kalsiyum, yüksek potasyum çözeltisi (2) geçiş. Kalp atandıktan sonra 2 dakika daha perfuse ve enzim çözeltisine geçin. Enzim çözeltisini, sindirimin başlangıcından 2 dk sonra rezervuara geri vermeye başlayın. 5 dk sindirimden sonra hızı 16 mL/dk’ya düşürün. Doku yumuşak göründüğünde (40-50 dakika sindirim), kanül kapalı kalp kesmek ve sol ventrikül ayırın. Mekanik ayrışma ile serbest hücreleri (yavaşça bir pipet ve doku tutmak için ince bir forseps ile doku ayırarak) çözüm engelleme. Hücre süspansiyonunu bir kafes (gözenek boyutu 1 mm2)ve 2 dk 2 22 x g (yerçekimi ivmesi) ile süzerem. Miyosit içermeyen süpernatantı çıkarın ve engelleme çözümünde CM’yi yeniden askıya alın. 4. CM’nin Kültürünün NOT: Steril koşullarda aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Seyreltik Laminin (Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom bazal membrandan, 1 mg/mL) 1:10 steril fosfat tamponlu salin (Ca2+/Mg2+olmadan) nihai konsantrasyona 100 g/mL. M199-Medium’da tablo 3’tebelirtildiği gibi eklerle kültür ortamı hazırlayın. M199-Medium’da hücre kültürü ortamı Kreatin [mM] 5 L-Karnitin hidroklorür [mM] 2 Taurin [mM] 5 Na-Pyruvat [mM] 1 İnsülin (sığır pankreası) [U/L] 0.25 Sitozin-β-D-arabinofuranoside [mM] 0.01 Gentamisin [mg/mL] 0.05 Tablo 3: Hücre kültürü ortamı. Steril filtre çözeltisi (0.22 μm) ve %5 Fetal Sığır Serumu ekleyin. Yama-kelepçe deneyleri için otoklav kapakları ø 16 mm, kalınlığı No. 0, culturing doğrudan önce 100 μg/mL lamin ile kaplayın. Karbon fiber deneyleri için Petri çanak yüzeyini poli (2-hidroksietil metakrilat) (poli-HEMA, 0.12 g/mL in 95:5 EtOH:H20) ile kaplayın ve katılaştırın.NOT: Hücreler poli-HEMA kaplı Petri kapları ‘sopa’ yok; bu hücre mekaniği çalışmalarında sürtünme-az daralma için çok önemlidir. CM yeniden askıya sonra (~ 10-15 dk) yerleşmiş, supernatant kaldırmak ve sonra kültür ortamda CM yeniden askıya. Neubauer haznesi ve tohumyoğunluğunda 17.500 hücre/mL’lik bir hedef yoğunlukta cm’yi laminin kaplı kapaklarda veya poli-HEMA kaplı Petri kaplarında sayın. 37 °C’de, %5 CO2’de 3-4 saat kuluçkaya yatırın. Kapaklı tohumlu hücrelerin orta (37 °C) değiştirin. 75 enfeksiyon (MOI) bir çokluğu gtacr1-eGFP için adenovirüs (tip 5) kodlama ekleyin ve 48 saat sonra fonksiyonel deneyler başlar.NOT: Transdüksiyondan sonra hücreleri karanlıkta tutun. Mavi veya yeşil ışıkla aktive edilmiş proteinlerle çalışırken kırmızı aydınlatma kullanın. GtACR1-eGFP’yi adenoviral vektöre kodlayan genleri klonlamak için ticari olarak kullanılabilen bir adenoviral dağıtım sistemi (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılır. Ilgi eklemek, burada GtACR1-eGFP, PCR güçlendirilmiş ve daha sonra bir IN-Fusion Klonlama reaksiyonu bir CMV organizatörü de dahil olmak üzere bir adenoviral vektör ile birlikte. CMV (insan sitomegalovirüs) organizatörü genellikle memeli hücrelerinde transgenlerin aşırı ekspresyonu sürücü için kullanılır. eGFP, Aequorea victoria’dan elde edilen ve maksimum 488 nm ve emisyon maksimum 507 nm olan gelişmiş yeşil floresan proteindir. Adenovirüs (tip 5) charité-universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp’ta üretildi.DİkKAT: Adenoviral transdüksiyon BSL-2 güvenlik seviyesi çalışması olarak sınıflandırılır ve yasal olarak uygun güvenlik önlemleri gereklidir. 5. Fonksiyonel deneyler NOT: Kayıtlar ters floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilir. GtACR1’in birlikte aktivasyonunu önlemek için iletim ışığını kondansatöre kırmızı bant geçişli filtre (630/20 nm) ile filtreleyin. Yama-kelepçe kurulumu Analogdan dijitale dönüştürücüile birlikte bir amplifikatör kullanın. Akım ve voltaj verilerini kaydetmek için bir veri toplama yazılımı kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).NOT: Kaydedilen veriler 10 kHz’de sayısallaştırılır ve 5 kHz’de filtrelenir. Karbon fiber kurulumu Optik kontrast (karbon fiberler koyu yapılar olarak görünür, striated hücre deseni üzerine overlaid) değişiklikleri izleyerek karbon fiber konumunu ve sarcomere uzunluğu algılamak için bir kamera kullanın. Kurulumun şematik gösterimi Şekil 3’tegösterilmiştir.NOT: Sarcomere uzunluğu, striation deseninin güç spektrumunun hızlı Fourier dönüşümü (FFT) kullanılarak gerçek zamanlı olarak hesaplanır. Şekil 3: Karbon fiber ölçümleri için deneysel kurulum gösteren şema. (Çizim ölçekte değildir). Bir hücreye iki karbon fiber bağlanır ve konumları bir piezo pozisyoner tarafından kontrol edilir. Pacer elektrik selülitleri için kullanılır. Çok renkli LED’ler nesne düzlemindeki hücrelerin aydınlatılmak için ters mikroskobun epifloresan portu ile birleştiğinde. LED güç, dijital analog dönüştürücünün (DAC) dijital çıkışı yla dijital darbeler alan özel bir kontrol kutusu aracılığıyla kontrol edilir. DAC, analog çıkış yoluyla floresan sistem arabirimi ile iletişim kurar. Hücresel görüntüleme için siyah-beyaz kamera (774 piksel 245 satır) sarcomere uzunluğu ve karbon fiber bükme izlemek için bilgisayara bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Zamanlı aydınlatma Floresan mikroskopisi ve ışık kapılı iyon kanallarının aktivasyonu için, farklı renkte üç LED’den oluşan harici bir özel yapım LED kontrol kutusu aracılığıyla ışık sağlayın (460 nm, 525 nm, 640 nm, bkz. Malzeme Tablosu). Veri toplama yazılım protokollerinde oluşturulan harici Time to Live (TTL) darbeleri ile LED’in kontrolüne izin verecek şekilde kontrol kutusu için mikrodenetleyici ve grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kodunu değiştirin (bkz. Malzemeler Tablosu). TTL darbeleri dijital analog dönüştürücü aracılığıyla LED kontrol kutusuna iletin. LED sürücü ve GUI üzerinden darbeler sayısını seçin. GUI komutu aldıktan sonra mikrodenetleyici yeni bir çekirdek üzerinde bir işlem başlatır. Bu süreçte Gui’den bir kontrol anahtarı seti olan TTL girişi ve kontrol anahtarı sürekli olarak kontrol edilecektir. TTL girişi pozitif olduğunda, mikrodenetleyici LED’i açar ve TTL girişini denetlemeye devam eder. TTL sinyali sıfıra döndüğünde, mikrodenetleyici LED’i kapatır ve bir kişi tarafından bırakılan darbe sayısını azaltır. Herhangi bir noktada kontrol anahtarı yanlışsa veya darbe sayısı sıfırsa, mikrodenetleyici GUI’den yeni bir komut alınana kadar bu işlemi durdurur. LED’leri doğrudan mikroskobun arka noktasına bağla. Nesne düzlemindeki ışık yoğunluğunun belirlenmesi Işıklı alanı bir kademe mikrometresi ile ölçün (nesnel büyütme 40x, A = 0,8 mm2). Optik güç ölçer kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu). Deneyleriçin ayarları tanımlayın: uyarma dalga boyu (525 nm), nesnel büyütme (40x), uyarma filtresi (530/20 nm) veya ayna ve çeşitli LED giriş gerilimlerinde ışık gücünü [W] okuyun. Işık gücünü [W] ışıklı alana bölerek [W/mm2]ışık yoğunluğunu hesaplayın [mm2] (burada: 0,8 mm2).NOT: 10 ms’lik kısa ışık darbe süreleri ve uzun sürelerin belirlenen değeri taşıyıp tutmamalarını kontrol etmek için 5.6 adımdaki ilgili protokollerle gerçek ışık gücünü ölçün(Ek Şekil 1). Yama-kıskaç deneyleri için hazırlık Aşağıdaki dış ve iç çözeltileri hazırlayın(Tablo 4; su gereksinimleri için bkz. Tablo 1). Glikozlu ozolarititi 300 ± 5 mOsmol/L’ ye ayarlayın.NOT: Kayıt günü için iç çözeltiyi buz üzerinde tutun. Dış çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Burada açıklanan yama-kelepçe çözümleri daha önce kullanılan çözeltilere dayanıyordu ve Cl- konsantrasyon daha düşük, daha fizyolojikseviyeleredeğiştirildi 7 . İlgili optogenetik aktüatörün iyon seçiciliğinin karakterizasyonu için, ekstra ve hücre içi çözeltilerde majör iyon konsantrasyonlarını (örneğin, Cl-, Na+, K+, H+ )değiştirmenizi öneririz19. Pipet tutucudan kayıt elektrodu çıkarın ve çok ince zımpara kağıdı ile gümüş klorür tabakasını gümüş telden çıkarın.NOT: Bu adımı her ölçüm gününün başında yapın. Teli 1,5 V pilin pozitif direğine bağlayın ve 10 dakika boyunca gümüş klorür kaplama için 3 M KCl çözeltiye batırın.NOT: Negatif kutup, 3 M KCl çözeltisine batırılmış bir referans gümüş telile bağlanır. Ölçüm odasını hazırlayın: ölçüm odasının çerçevesine silikon gres koyun ve haznenin mühürlü olduğu çerçevenin üstüne bir kapak kayması (çap: 50 mm, kalınlık No. 0) yerleştirin. Banyoya bir referans gümüş/ gümüş-klorür pelet elektrot koyun ve baş sahne ile bağlayın. Çekme 1.7 – 2.5 MΩ yama pipetler soda kireç cam kılcal (dış çapı: 1,55 mm, iç çapı: 1,15 mm) bir micropipepuller ile (Malzeme Tablosubakınız). Veri toplama yazılımı başlatın ve membran testini ayarlayın (15 ms için darbe 10 mV, bazal 0 mV). Dış banyo solüsyonu Dahili pipet çözeltisi NaCl [mM] 140 – KCl [mM] 5.4 11 CaCl2 [mM] 1 – MgCl2 [mM] 2 2 Glikoz [mM] 10 – HEPES [mM] 10 10 K-Aspartat [mM] – 119 Mg-ATP [mM] – 3 EGTA [mM] – 10 Ph 7.4 (NaOH) 7.2 (KOH) Ozmolarite (Glikoz ile ayarlayın) [mOsmol/L] 300 ± 5 300 ± 5 Tablo 4: Yama-kelepçe çözeltileri. Yama-kelepçe ölçümleri için protokoller -74 mV tutma potansiyelinde V-kelepçe modunda fotoaktivasyon protokolünü kaydedin. 300 ms’lik ışık darbeleri kullanın.NOT: Kültürlü CM’nin dinlenme membran potansiyeline yakın V-kelepçe kayıtları nın (I-kelepçeile oluşturulmuş; ellerimizde -79 mV ile -77 mV arasında hem transduced hem de transduced CM19için) gerçekleştirmenizi öneririz. Yeni izole edilmiş hücreler ortalama istirahat membran potansiyeli -79 mV(Ek Şekil 2, sıvı bağlantı potansiyeli için düzeltilmeden sonra tüm değerler) gösterir. AP’yi 0 pA’da I-clamp modunda kaydedin. Elektriksel voltaat için, 10 ms’lik akım darbeleri enjekte edin (rampa dan 10 ms içinde belirlenen değere 0 pA), 0,25 Hz ve AP. Ap’yi eşikten daha fazla enjeksiyonlarla kaydetmek için eşiği bulun. Optik pacing için güvenilir AP ortaya çıkarmak için minimum ışık yoğunluğunda 10 ms, 0,25 Hz ışık darbeleri kullanın. 0 pA’da I-clamp modunda fotoinhibisyonu kaydedin. Adım 5.6.2.1’de açıklandığı gibi AP’yi elicit ve 15 elektriksel tetiklenen AP’den sonra 4 mW/mm2’de 64 s için sürekli ışık uygulayın.NOT: Şekil 6F, sürekli ışık sırasında daha yüksek akım enjeksiyonlarının uygulandığı bir fotoinhibisyon protokolü gösterir. Eşik 1,5 katından başlayarak (burada: 0,7 nA) enjekte edilen akım 0,1 nA (son seviye: 2,2 nA) adımlarında artırıldı. Tüm test akım genlikleri, sürekli ışık uygulaması AP nesil inhibe. Bir kontrol deneyi olarak, ışık uygulaması olmadan 64 s için elektriksel stimülasyon duraklatın. Yama-kelepçe deneyleriNOT: Aşağıdaki deneyleri karanlıkta gerçekleştirin (kırmızı ışık mavi/yeşil ışıkla etkinleştirilen araçlar için kullanılabilir). Dış çözelti ile ölçüm odasına hücreleri ile coverslip yerleştirin ve floresan CM seçin.NOT: eGFP pozitif hücreler bant geçişli uyarma filtresi (450 nm – 490 nm), 510 nm dikroik ayna ve 515 nm uzun pas emisyon filtresi ile birlikte mavi LED (460 nm) kullanılarak tespit edilebilir. Diğer floresan etiketler kullanılırsa, ilgili LED ve floresan filtre kümelerini kullanın. Yüksek transdüksiyon verimi elde edilirse (gtacr1 adenovirüs ile ellerimizde >), fonksiyonel deneylerden önce eGFP floresansını kontrol etmeye gerek yoktur; bu potansiyel GtACR1 ön aktivasyon önler. Yama pipetini iç solüsyonla doldurun. Uçta hava kabarcığı olmadığından emin olun. Pipet tutucuya pipet takın ve iç çözeltiye gümüş klorür kaplı gümüş teli yerleştirin. Hücreye bağlı yapılandırmaya ulaştıktan sonra, -74 mV tutma potansiyeline sahip veri toplama yazılımında tam hücre moduna geçin. Tüm hücre yapılandırmasına erişmek için hafifçe negatif basınç uygulayarak membranı yırtın. Bu ölçülen kapasitans ani bir artış ile gösterilir. Bölüm 5.6’da açıklanan protokolleri çalıştırın. Karbon fiber tekniği Karbon fiberler üretin. Aşağıdaki parametrelere sahip cam kılcal damarlar kullanın: dış çap: 2,0 mm, iç çap: 1,16 mm, uzunluk: 100 mm (Bkz. Malzeme Tablosu). Mikropipet çekmecesi kullanarak, cam kılcal damarı aynı uzunluktaiki pipete (toplam konik uzunluğu ~11 mm, Şekil 5)~30 μm’lik son bir iç çapa doğru çekin.NOT: Birinci ve ikinci çekme için kullanılan ayarlar sırasıyla ,2 (çekmecenin maksimum çıkışıyla orantılı) ve ,0’dır (çekmeceye, tipe ve yasta bağlıdır). Pipetleri 12 V, 24 A ayarlarını kullanarak kendi kendine yapılmış bir mikro forge ile 45°’ye kadar bükün (pipet bükme kurulumunun ayrıntıları için Şekil 4’e bakın). Kapilleri (2) oryantasyon çemberindeki kırmızı çizgiüzerinde hizalayın (5), kapiller sabitin konumlandırılmasını koruyun, böylece büküm kısmının uzunluğu yön döngüsünün merkezinden sonra (4,5 mm yarıçap) her zaman aynıdır. Kılcal damarı bükücü (3) ile kılcal damarın ucunu aşağı iterek 45° (yeşil çizgi) bükün ve kılcal damar ılımantma (4) ile bükücü çıkarıldıktan sonra bile 45° açı yakalayana kadar ısıtın. Karbon fiberleri (Prof. Jean-Yves Le Guennec’ten sağlanan) stereo mikroskop altında cam kılcal damarın ince ucuna sığdırın. Kavramayı artırmak ve liflere zarar verme riskini azaltmak için sonunda yumuşak borulu ince prupler kullanın.NOT: Bu lifler, lifler ve hücreler arasındaki temas yüzeyini artıran ve yapışmayı artıran mikroyapılar ile karakterizedir20. 2 mm uzunluğunda karbon lifleri kesin ve kapiller ön bölümüne lif düzeltmek için süper tutkal (siyanoakrilat) kullanın.NOT: Lifler ne kadar uzun sayılsa, aynı kuvvetin uygulanması üzerine o kadar çok eğilirler. Karbon fiberleri kalibre edin. Karbon fiberleri 0,05 mN/V hassasiyeti ve 0 – 0,5 mN kuvvet aralığı ile bir kuvvet dönüştürücü kullanarak kalibre edin (Bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Bu kurulum, “çekme” yerine sıkıştırmayı ölçmek için özel olarak yapılmıştır. Bir micromanipülor ve piezo motor tarafından kontrol edilen bir tutucu karbon fiber ile kılcal bağdaştırın. Lifin ucunu kuvvet sensörüyle temas halinde yerleştirin, ancak herhangi bir kuvvet üretmeden piezo motorunu 10 μm (toplam hareket 60 m) adımda sensöre doğru hareket ettirin ve Volt’taki ölçülen gerilimi(E)okuyun.NOT: Kuvvet dönüştürücükarbon fiber serbest ucunun çok ucu ile temas olduğundan emin olun. Bu ölçümleri üç kez tekrarlayın. Her piezo pozisyonunun kuvvetini hesaplamak için Formula 1’i kullanın (Piezo motor adımları arasındaki ölçülen geriliminΔΕ farkı):NOT: Kuvvet dönüştürücüsünün hassasiyeti transdüserin modeline bağlıdır (burada: 0.05 mN/V = 50 μN/V). Kazanç denetleyicide ayarlanabilir. Kuvveti [μN] piezo konumuna karşı çizin. Eğim lif sertliğine karşılık gelir [μN/μm]. CM sözleşme rekor kuvvet.NOT: Aşağıdaki deneyleri karanlıkta gerçekleştirin (kırmızı ışık mavi/ yeşil ışıkla etkinleştirilen araçlar için kullanılabilir). Ölçüm odasının yüzeyini poly-HEMA ile kaplar. Ölçüm odasını dış banyo solüsyonuyla doldurun ve kültür hücre süspansiyonundan birkaç damlayı hazneye koyun (adım 4.9). Sahne mikromanipülatör karbon lifleri ile kılcal damarlar takın. Kısa yeşil ışık darbeleri uygulama ile kasılmaları neden yeteneğini kontrol ederek GtACR1 ifade CM’yi seçin. Karbon fiberleri ölçüm odasının yüzeyine yakın yatay olarak hizala. Hücre yüzeyine ilk lif indirin. CM’nin diğer ucundaki ilk elyafa paralel ikinci elyafı takın. İdeal hizalama hücre eksenine yakın-diktir.NOT: Hücreyi yavaşça alt yüzeye iterek lifi takın. İkinci elyaftakmadan önce basıncı bırakın. İkinci lif takarak hücreyi esnetmayın. Her iki lif de hücreye bağlandıktan sonra, lifleri kaldırın, böylece hücre artık oda yüzeyine temas etmez ve herhangi bir sürtünme olmadan bulaşabiliyor. Veri toplama yazılımındaki sarcomere’leri odakla (Bkz. Malzeme Tablosu)ve lifler arasında sarcomere uzunluk izleme penceresini(Şekil 7A I (3) )ayarlayın.NOT: Ortaya çıkan FFT güç spektrumu(Şekil 7A I (2)ideal olarak bir keskin tepe gösterir ve ortalama sarcomere uzunluğunu gösterir. Kenar algılama modüllerini kullanarak fiber bükmeyi izleyin. Algılama alanlarını kırmızı ve yeşil pencereyle ayarlayın ve ışık yoğunluğu izlemenin ilk türevi olan bir eşik (kırmızı ve yeşil yatay çizgi) tanımlayın(Şekil 7A III). 0.25 Hz (mümkünse, daha hızlı pacing oranları deneyin) ve sarcomere uzunluğu ve lif bükme izlemek hücre optik hız başlar.NOT: Fiber tutucu pozisyonu, LED tetikleme ve elektrik stimülasyon darbeleri veri toplama yazılımı ile kontrol edilir (bkz. Malzeme Tablosu). En az 15 optik olarak ortaya konan kasılmaları kaydettikten sonra, hücreyi elektriksel olarak uyarın (Bkz. Malzeme Tablosu). Eşik geriliminin 1,5 katı uygulayarak kasılmaları ortaya çıkarmak ve kaydetmek için eşiği bulun. İnhibisyon protokolü için, kasılmaları ortaya çıkarmak için elektriksel uyaranları uygulayın ve daha sonra 64 s (çeşitli ışık yoğunluklarında) sürekli ışığa maruz. Şekil 4: Pipet bükme kurulumu. (1) Sol taraftaki mikromanipülatör kılcal damarın konumunu kontrol etmek için, sağdaki ikinci bir mikromanipülatör ise bükülmek için kullanılır. (2) Kılcal damar. (3) Bender. (4) Mikroforge. (5) Oryantasyon çemberi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Karbon fiberli pipet. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 6. Veri analizi Yama kelepçesi kayıtlarıNOT: Deneyden sonra sıvı bağlantı potansiyeli için kaydedilen tüm ve komut gerilimlerini düzeltin. Takım bağlantı potansiyeli hesap layıcısı kullanarak veri toplama yazılımındaki sıvı bağlantı potansiyelini belirleyin (Tablo 4’tebelirtilen yama-kıskaç çözümleri için : 21 °C’de 14,4 mV). Sıvı bağlantı potansiyelini kaydedilen/komut geriliminden çıkarın. I-clamp AP kayıtları için, optik pacing karşı elektrik pacing kontrol edin. AP süresini (APD) özel olarak yazılmış bir komut dosyası(Tamamlayıcı Malzeme)ile ve repolarizasyonda hesaplayın. Dinlenme membranı potansiyelini ve AP genliğini belirleyin.NOT: Wang K. ve ark.21’de açıklandığı gibi APD’yi belirleyin .abf dosyalarını yüklemek için komut dosyasına genellikle aşağıdaki bağlantı dan erişilebilir: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. En az 6 AP için ortalama APD değerleri. V-clamp fotoaktivasyonu için taban çizgisinin 0 pA olup olmadığını kontrol edin. Taban çizgisini sıfıra ayarlamazsanız. -74 mV’de 300 ms ışık darbelerinin tetiklediği kaydedilen akımı analiz edin. Verileri veri analizi yazılımına aktarın ve en yüksek ve ortalama sabit akımı belirleyin. Karbon fiber deneyleri Optik pacing sırasında daralma kayıtları: Veri toplama yazılımında kaydedilen verileri yükleyin ve karbon fiber bükme ve sarcomere uzunluğu değişiklikleri temel ve maksima okuyun.NOT: Kararlı bir kaydın 10 kasılmaları için ortalama değerler. Hücre genişliğini ölçün ve eliptik bir kesit varsayarak hücrenin kesit alanını hesaplayın(Şekil 7B II).NOT: Bir elipsin alanının formülü A = π·a·b (Formula 2) olup, a merkezden tepe ye uzaklık, b ise merkezden ortak tepe ye olan uzaklıktır. Bizim durumumuzda bu a = (hücre genişliği)/2 ve b = (hücrenin kalınlığı)/2 anlamına gelir. Nishimura ve ark.22’ye göre CM kalınlığıhücre genişliğinin üçte biri olarak tahmin edilebilir, böylece A = π· (1/2)·width· (1/2)·thickness = π· (1/4)·width· (1/3)·width = π· (1/12)·genişlik2. Son sistolik kuvveti (F) hesaplayın: Son sistolik hücre deformasyonu (ESD) hesaplamak:NOT: Diğer kontraktil parametreler analiz edilebilir: sarcomere uzunluğu dinlenme, zirveye zaman, zaman% 90 gevşeme, fraksiyonel sarcomere kısaltma, daralma ve gevşeme maksimum hız (yazılım satın alma kılavuzuna bakın).

Representative Results

GtACR1-eGFP kültürlü tavşan CM(Şekil 6 insert) ile ifade edildi ve fotoakımlar yama-kelepçe tekniği ile ölçüldü. GtACR1 fotoaktivasyonu -74 mV’de büyük içe doğru yönlendirilmiş akımları gösterir. Şekil 6’da4 mW/mm2’de bir tepe akımı(I P)245 pA’dır. AP, sırasıyla 10 ms’lik kısa depolarize ışık darbeleri ile elektriksel olarak(Şekil 6B) veya optik(Şekil 6C)tetiklendi. APD değerlerini analiz eden elektriksel olarak tempolu CM, 0,24 ± 0,08 s’lik APD 20 ve 0,75 ± 0,17 s’lik BIR APD 90, optik tempolu CM 0,31 ± 0,08 s’lik BIR APD 20 ve 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2) apd 90 gösterirken, burada sunulan örnek APD 20elektrik = 0,17 s; APD 20optik = 0.27 s ve APD 90elektrik = 0.61 s; APD 90optik = 0.68 s; Şekil 6D). Optik tempolu CM daha yavaş AP başlangıcı gösterir (Şekil 6D). CM aktivasyonu, membran potansiyelini klorür ters potansiyeline doğru polarize ederek sürekli aydınlatma (64 s, 4 mW/mm2)üzerine inhibe edildi, burada -58 mV (Şekil 6E). Eşik 1,5 kat daha yüksek akım enjeksiyonları AP üretimi ortaya çıkarmak değil (Şekil 6F). Karbon fiber bükmeden oluşturulan tepe kuvvetleri belirlendi (Şekil 7B,C,E). CM, optik pacing(Şekil 7C)sonrasında elektriksel pacing(Şekil 7B) ve 261 μN/mm 2 232 μN/mm2 üreşetilmiştir. Uzun süreli yeşil ışık darbeleri kasılmaları inhibe eder (Şekil 7E). 64 s için optik inhibisyonun ardından, tekrarlayan kasılmalar daha düşük bir kontraktil kuvvet oluşturur ve kuvvet değerleri tavşan CM’den gelen diyastolik kalsiyum kaybına uygun olarak ~10 kasılmadan (0,25 Hz, Şekil 7D’de)sonra taban çizgisine doğru gerileşir. Şekil 6: Elektriksel ve optik tempolu/inhibe CM’nin temsili yama-kelepçe kayıtları. (A) 300 ms, 4 mW/mm2ışık darbesi ile -74 mV’de temsili fotoakım. IP tepe akımını gösterir. Kesici uçgtacr1-eGFP pozitif hücre gösterir. (B) Temsilci AP kaydı 0 pA’da 10 ms’lik bir akım rampası kullanarak, 0.6 nA’lık bir rampa kullanarak CM. (C) Temsilci AP kaydı nı 10 ms, 0.4 mW/mm2ışık darbeleri kullanarak 0 pA’da kaydettiriniz. (D) Üst grafik, elektriksel (mavi) ve optik (yeşil) aktive CM. AP’nin 10AP’sinin altkısmını membran potansiyelindeki maksimum değişimle (dV/dt max) hizalanmış olarak gösterir. Alt grafik optik ve elektrikle tetiklenen AP(Eoptik-Eelektrik)arasındaki membran potansiyelinin farkını gösterir. (E) Elektrikle tetiklenen AP 64 s, 4 mW/mm2sürekli ışık altında inhibe edildi. (F) AP, sürekli ışık altında eşiğin 1,5 katından (0,1 nA’den 2,2 nA’ye kadar) daha yüksek akım enjeksiyonları ile inhibe edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Optik ve elektriksel olarak tempolu/inhibe CM karbon fiber kayıtlarından elde edilen temsili veriler. (A) Veri toplama yazılımında görüntülenmesi. Resim (I) sarcomere uzunluğu hesaplamak için pencere ile ölçülen CM gösterir. Hücre genişliği turuncu olarak etiketlenir. (1) İlgili frekansaralığı. (2) FFT güç spektrumu hücredeki sarcomere aralığının frekansını gösterir. Ortalama sarcomere uzunluğu en yüksek frekanstan hesaplanır. (3) Sarcomere uzunluk izleme penceresi. (4) Yoğunluk izi. (5) Hamming penceresi ile çarpılarak yapılan yoğunluk izi pencereli yoğunluk izidir. Şema (II) hücrenin eliptik kesitini gösterir. Turuncu genişlik ve kesik mavi kalınlığı. Resim (III) ilgili algılama kutuları ile karbon fiberkonumunu gösterir, kırmızı ve sağ yeşil sol. (6) Yoğunluk izi. (7) Yoğunluk izleme ilk türevi (veri toplama yazılım kılavuzuna bakın). (B) Elektriksel olarak ortaya çıkarılalı kasılmalar temsili iz. Panel (I) sarcomere uzunluğu kısalma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki mesafe. (C) Optik olarak ortaya konan kasılmalar (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2)temsili eser. Panel (I) sarcomere uzunluğu kısalma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki mesafe. (D) AP neslinin inhibisyonundan kaynaklanan bir duraklamadan sonra 1’den 11’e kadar daralmadan oluşan pik kuvvet oluşturuldu. (E) Sürekli aydınlatma altında kasılmalar optik inhibisyonu temsilcisi iz (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) sarcomere uzunluğu kısaltma gösterir, panel (II) iki karbon lifleri arasındaki uzunluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. A Alan Acr aniyon kanalrhodopsin Ap eylem potansiyeli Apd eylem potansiyeli süresi Cfu koloni oluşturan birim Chr kanalrhodopsin Cm kardiyomiyosit eGFP gelişmiş yeşil floresan protein Esd sistolik hücre deformasyonu sona erdirmek Ab endotoksin üniteleri F Kuvvet Fft hızlı Fourier dönüşümü GTACR Guillardia teta aniyon kanalrhodopsin Guı grafikkullanıcı arabirimi I-kelepçe akım kelepçesi ıu uluslararası birimler Moi enfeksiyonun çokluğu poli-HEMA poli(2-hidroksitil metakrilat) V-kelepçe gerilim kelepçesi Tablo 5: Kısaltmalar listesi. Ek Şekil 1: Optik güç ölçer ile ışık yoğunluğu ölçümleri. (A) 4 mW/mm2’de10 ms ışık darbelerinin ölçümü . (B) 4 mW/mm2’de64 s sürekli aydınlatmaölçümü . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 2: Taze izole CM özellikleri ve kültürde yapısal adaptasyon. (A) AP kaydı yeni izole cm (APD 20 1.11 ± 0.34 s, APD 90 1.96 ± 0.32 s, n = 7, N = 2). Ortalama istirahat membran potansiyeli -79.3 ± 0.8 mV (n = 7, N = 2). (B) Elektriksel olarak tempolu yeni izole cm. Ortalama pik kuvvet 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2) karbon fiber kaydı. (C) Yeni izole edilmiş bir CM’nin konfokal görüntüleri (I); transdükssüz (II) ve transduced (III) CM kültürde 48 saat sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Malzeme: APD ve dinlenme membranı potansiyelini belirlemek için MatLab komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Optogenetik araçlar, ekstremite hücre elektrofizyolojisinin invaziv olmayan bir şekilde modülasyonunu sağlarken, belirli bir deneysel tasarım için mevcut en iyi aracı seçmek için farklı hücre tiplerinde (örneğin, CM) ayrıntılı karakterizasyona ihtiyaç duyarlar. Yama-kelepçe tekniği hücresel elektrofizyolojiyi değerlendirmek için standart bir yöntemdir. Tüm hücre konfigürasyonunda, ışık stimülasyonu/inhibisyonu sonrasında plazma zarı boyunca foto-aktive akımları veya membran voltajındaki zamansal değişimleri kaydetmeolanağı sağlar. Elektriksel uyarma optogenetik manipülasyon da CM kasılmaları etkiler. Optik sorgulamanın miyositlerin mekanik aktivitesi üzerindeki etkilerini ölçmek için sarcomere izleme ve karbon fiber destekli kuvvet ölçümleri kullanıyoruz.

Cm’deki ışık kapılı klorür kanalı GtACR1’in temel etkilerini karakterize eden bir protokol uyguluyoruz. Model sistem olarak, elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, AP şekli ve refrakter dönem) insan CM’sinde kemirgen CM’den daha yakından gözlenenlere benzediği için tavşan CM’yi seçtik. Ayrıca, tavşan CM birkaç gün için kültürlü olabilir, yeterince uzun adenoviral teslimat ve GtACR1-eGFP ekspresyonu için. Özellikle, izole CM hücre uçları yuvarlama ve çapraz striation kademeli kaybı da dahil olmak üzere zaman içinde kültür yapısal özelliklerini değiştirmek, T-tübüler sistem ve caveolae²³^,²⁴. Buna uygun olarak, fonksiyonel değişiklikler kültürlü CM bildirilmiştir: dinlenme membran potansiyelinin depolarizasyonu, AP’nin uzaması ve hücresel Ca²⁺ kullanımındaki değişiklikler. Kültürdeki hücresel adaptasyonların gözden geçirilmesi için lütfen Louch ve ark.^25’ebakınız. Ek Şekil 2, burada sunulan protokolü kullanarak kültürlü CM(Şekil 6, Şekil 7)gözlenenlerle karşılaştırmak için taze izole CM’nin örnek AP ve daralma ölçümlerini göstermektedir.

Tüm hücreli yama-kelepçe kayıtları, fotoakım özelliklerinin (örn. genlikler ve kinetikler) ve yüksek zamansal çözünürlükte membran potansiyelinde veya AP karakteristiklerinde ışık kaynaklı değişikliklerin doğrudan ölçümlerini sağlar. Ancak, bu tür kayıtların çeşitli sınırlamaları vardır: Birincisi, sitosol iyonik elektrokimyasal gradyanları kontrol etmek için avantajlı olan tüm hücre kayıtlarında pipet çözeltisi ile değiştirilir, ancak hücresel organeller, proteinler ve diğer bileşiklerin yıkanması içsel dezavantajı vardır, böylece potansiyel hücresel elektrik yanıtlarını etkileyen. İkinci olarak, fizyolojik olarak uzun depolarizasyondan kaynaklanan ek iyon kanallarının aktivasyonu gibi yan etkiler (örn. ışık kapılı iyon kanallarının yavaş zaman sabitleri) yöntemimiz sadece APD’deki değişiklikleri algılamaya izin verdiği nden, ancak elektrofizyolojik olarak ilgili hücre bölmelerinde iyonik konsantrasyonların doğrudan ölçümlerini yapmamak nedeniyle değerlendirmek zordur. Bu, floresan göstergeler (örneğin, Ca²⁺ sensörleri) veya iyon seçici elektrotlarla yapılabilir. Daha fazla karakterizasyon ışık yoğunluğu titrasyonları içerebilir, pH-bağımlılık belirlenmesi, farklı membran potansiyellerinde fotocurrent kinetik, ve tekrarlayan ışık stimülasyonu sırasında kurtarma kinetik.

Yama-kıskaç kayıtlarının aksine, tek hücreli kuvvet ölçümleri, hücre içi ortamlarını etkilemeden bozulmamış miyositlerin hücresel kasılmaları analizini sağlar. Iyon konsantrasyonları üzerindeki ikincil etkiler (örneğin, Ca²⁺) üretilen kuvvet genliği ve dinamiği (örn. maksimum daralma ve gevşeme hızı; burada analiz edilmez) belirlenerek dolaylı olarak değerlendirilebilir. Karbon fiber tekniği ile kuvvet ölçümleri, önceden yüklenmiş hücrelerdeki pasif ve aktif kuvvetler hakkında doğrudan bilgi sağladıkları için serbestçe daralan hücrelere göre avantajlıdır (örneğin, in situ veya in vivo ayarlarına daha çok benzeyen koşullarda). Mekanik ön yükleme özellikle hücresel kontraktür analiz ederken önemlidir, streç kuvvet üretimi ve gevşeme etkiler gibi²⁶^,²⁷.

Optogenetik yaklaşımlar, hem tek CM hem de sağlam kardiyak dokuda hücre zarı potansiyelinin spatiotemporal derecede hassas manipülasyonuna olanak sağlar. Klasik olarak, Hafif kapılı katyon non-selektif bir kanal olan ChR2 membran potansiyelinin depolarizasyonu için kullanılırken, membran hiperpolarizasyonu için ışık tahrikli proton ve/veya klorür pompaları kullanılmıştır. Her iki grup da optogenetik aktüatörler yüksek ekspresyon düzeyleri gerektirir, çünkü ChR2, özünde düşük tek kanallı iletkenlik²⁸ ve ışık tahrikli pompalar emilen foton başına maksimum bir iyon taşır. Ayrıca, CM ChR2 uzun süreli aktivasyonu Na yol açabilir⁺ ve / veya Ca^{2 +} aşırı, ve ışık tahrikli pompalar trans-sarcolemmal H değişebilir⁺ veya Cl^– gradyanlar²⁹^,³⁰. CM aktivitesinin optogenetik kontrolü için alternatif araçlar ararken, son zamanlarda chr2 gibi katyon ChR ile karşılaştırıldığında üstün bir tek kanal iletkenliği ve daha yüksek ışık hassasiyeti ile karakterize doğal anyon channelrhodopsin GtACR1 test etti. GtACR1 aktivasyonunun CM’yi depolarize ettiğini ve ışık darbesi zamanlaması ve süresine bağlı olarak optik volta ve inhibisyon için kullanılabileceğini bulduk. Katyon ChR yerine ACR kullanmanın ek bir avantajı Cl daha olumsuz ters potansiyeli olabilir^– Na⁺ile karşılaştırıldığında , yapay iyon akımları tanıtılan azaltarak. Daha önce de gösterdiğimiz gibi, GtACR1 ile optik pacing DAHA Hızlı GtACR1 mutantlar kullanılarak aşılabilir GtACR1 kanal kapatma yavaş bileşeni nin bir sonucu olarak AP uzama yol açabilir¹⁹. Ancak, AP uzaması daha düşük, daha fizyolojik hücre içi^Cl – konsantrasyonu kullanırken çok daha az belirgindir (Bkz. Şekil 6). Ayrıca, GtACR1 aracılı inhibisyonu ile uzun süreli aydınlatma sonuçları derin membran depolarizasyonu, hangi tekrar ikincil Na^aktive edebilir + ve Ca^{2 +} akını, bu nedenle voltaj kapılı kanalların etkinliğini değiştirerek. Ölçümlerimizde, AP ve kasılma parametrelerinin 1 dakika boyunca ışık kaynaklı inhibisyondan sonra 40 s içinde taban çizgisine gerildiğini görüyoruz (bkz. Kopton ve ark. 2018, Şekil 6, Şekil 7). Işık kapılı K⁺ kanalları CM dinlenme membranı potansiyelini etkilemeden CM susturma için güçlü bir alternatif sunuyoruz^31.

Gelecekte, kardiyak aktiviteyi inhibe etme potansiyelleri için farklı optogenetik araçları nicel olarak karşılaştırmak istiyoruz. Bu amaçla, ACR, ChR2 ve kırmızı-shifted ChR varyantları³²de dahil olmak üzere ışık kapılı iyon kanalları çeşitli test , yanı sıra halorhodopsin veya ışık kapılı adenylyl siklaz bPAC potasyum kanal SthK (PAC-K)³¹ile birlikte hiperpolarize aktüatörler .

Burada sunulan protokol CM elektromekanik özellikleriderinlemesine karakterizasyonu için kullanılabilir. Esas olarak diğer türlerden CM ve hastalıklı miyokardyumizole CM için de geçerlidir. Optik stimülasyon, kişinin cm’yi farklı frekanslarda hızlandırmasına olanak tanır ve karbon fiber daralma deneyleri sırasında farklı ön yükler test edilebilir. İlginç bir deney, hastalık progresyonu sırasında kardiyak doku remodeling gelişimi sırasında gözlenebilir, istirahat membran potansiyelinde kademeli artış taklit etmek, eşik altı depolarizasyon için düşük yoğunluklu aydınlatma kullanmak olacaktır. Son olarak, fonksiyonel ölçümler uyarma-daralma kaplini hakkında daha fazla bilgi edinmek için Ca²⁺ görüntüleme ile veya farklı ilaçların CM aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için farmakolojik müdahalelerle kombine edilebilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Stefanie Perez-Feliz’e mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Almanya) pUC57-GtACR1 plazmid, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) için adenovirüs üretimi ve Dr. Anastasia Khokhlova (Ural Federal Üniversitesi) hücre izolasyonunu geliştirmek ve bükme boru sularını yeniden tasarlamak için uzmanlığını paylaşmak için. Proje Alman Araştırma Vakfı (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether bursu: SCHN1486/2-1) ve ERC Advanced Grant CardioNECT.

Materials

Equipment – Cell isolation/Culturing/Transduction
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV	TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
Aortic cannula	Radnoti		4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0151	Borosilicate Glass
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm	Samuel Findings, London, UK	TSGBL3
Incubator	New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland	Galaxy 170S
Langendorff-perfusion set-up	Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany		Custom-made
Langendorff-pump	Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland	ISM444
Mesh: Nylon Monodur filter cloth	Cadisch Precision Meshes Ltd		800 µm holes, 1 m wide
Neubauer chamber	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	717806
Rabbit, New Zealand White	Charles River	Strain Code: 052
Scissors	Aesculap AG, Tuttlingen, Germany	BC774R	Bauchdeckenschere ger. 18cm
Sterile filter, 0.22 µm	Merck, Darmstadt, Germany	SLGP033RB
Equipment – Patch-clamp
Amplfier	AxonInstruments, Union City, CA, United States	Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	631-0178	Borosilicate Glass
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, San José, CA, United States	1550A
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878	BZ:00
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Headstage	AxonInstruments, Union City, CA, United States	CV203BU
Interface	Scientifica, Uckfield, UK	1U Rack, 352036
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States	PT-120-G
LED control software	Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system	custom-made
Micropipette Puller	Narishige Co., Tokyo, Japan	PP-830
Microscope inverted	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
Motorised Micromanipulator	Scientifica, Uckfield, UK	PatchStar
Optical power meter	Thorlabs, Newton, NJ, United States	PM100D
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Silver wire	A-M Systems, Sequim, WA, United States	787500	Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet
Soda lime glass capillaries	Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark	160213 BRIS, ISO12772	1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, United States	Version 10.5
Software MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Stage micrometer	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Equipment – Carbon fiber
Carbon fibers	provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec		BZ:00
Digitizer Axon Digidata	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States	1550B
Filter (530/20)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513878
Filter (630/20)	Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States	227155
Fluorescence System Interface	IonOptix, Milton, MA United States	FSI-800	2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Force Transducer System	Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada	406A
Glass capillaries for force measurements	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States	GC200F-10
Interface National Instruments	National Instruments, Budapest, Hungary	BNC-2110
LED 525 nm	Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States	PT-120-G
LED control box	Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system	custom-made
Microcontroller	Parallax Inc., Rocklin, California, United States	Propeller
Micropipette Puller	Narishige Co., Tokyo, Japan	PC-10
Microscope inverted	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI4000B
MyoCam-S camera	IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S camera Power	IonOptix, Milton, MA, United States	MCS-100
MyoPacer Field Stimulator	IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States	MYP100
Piezo Motor	Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	E-501.00
Silicone Grease	RS Components, Corby, UK	494-124
Software Axon pClamp	Molecular Devices, San José, CA, United States	Version 10.5
Software IonWizard	IonOptix, Dublin, Ireland	Version 6.6.10.125
Software MatLab2017	The MathWorks, Inc.
Stage micrometer	Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK	1 mm
Chemicals
Adenosine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A9251-100G
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A7030-50G
CaCl₂	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA	21114-1L
L-Carnitine hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C9500-25G
Collagenase type 2, 315 U/mg	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS004177
Creatine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C0780-50G
Cytosine-β-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	C1768-100MG
EGTA	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	3054.3
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL	Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany	PZN-07829486
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	F9665
Gentamycin 50 mg/mL	Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA	15750-037
Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	G7021-1KG
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL	Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	PZN-03029843
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	H3375-1KG
Insulin (bovine pancreas)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	I6634-50MG
K-aspartate	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A6558-25G
KCl	VWR International GmbH, Leuven, Belgium	26764.260	1 mg/mL
KOH	Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA	35113-1L
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	L2020-1MG
M199-Medium	Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States	M4530
Mg-ATP	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	A9187-1G
MgCl₂	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	63069-500ML
NaCl	Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK	10428420
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9%	Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	3200950
NaOH	AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany	A6579	without Ca²⁺/Mg²⁺
Na-pyruvat	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	P2256-100MG
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	D1408-500ML
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma, Poole, UK	192066
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	P5147-1G
Taurine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	T0625-500G
Thiopental Inresa 0.5 g	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	PZN-11852249
Xylazine hydrochloride, Rompun 2%	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	PZN-01320422

References

Harz, H., Hegemann, P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas. Nature. 351, 489-491 (1991).
Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature. 271, 476-478 (1978).
Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium. Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).
Schobert, B., Lanyi, J. K. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).
Inoue, K., et al. A light-driven sodium ion pump in marine bacteria. Nature Communications. 4, 1678 (2013).
Han, X., et al. A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).
Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2. Scientific Reports. 8, 9316 (2018).
Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), 409-412 (2014).
Berndt, A. Structure-Guided Transformation. Science. 344 (6182), 420-424 (2014).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
Mohamed, G. A., et al. Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins. BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).
Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing. Scientific Reports. 7, 13823 (2017).
Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics. Scientific Reports. 6, 33530 (2016).
Kopton, R. A., et al. Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels. Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).
Peyronnet, R., et al. Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).
Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
Nishimura, S., et al. Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).
Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).
Burton, R. A. B., et al. Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation. Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).
Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
Janssen, P. M., Hunter, W. C. Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction. The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).
Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).
Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
Schneider-Warme, F., Ravens, U. Using light to fight atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).
Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
Bernal Sierra, Y. A., et al. Potassium channel-based optogenetic silencing. Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).
Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss, R., Kohl, P., Peyronnet, R., Schneider-Warme, F. Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity. J. Vis. Exp. (157), e60490, doi:10.3791/60490 (2020).