인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여
Summary
막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
백색 지방 조직 (WAT) dysregulation는 인슐린 저항과 타입-2 당뇨병 (T2D)의 발달에 있는 중앙 역할을 합니다. T2D에 대 한 새로운 치료를 개발 하려면, 더 생리적으로 관련 된 체 외 지방 세포 모델이 필요 하다. 이 연구는 성숙한 인간 지방세포들을 분리하고 배양하는 새로운 기법을 설명한다. 이 방법은 MAAC (막 성숙한 지방 세포 골재 배양)의 제목이며, 시험관 내 다른 지방 세포체 모델과 비교하여, MAAC는 갓 분리 된 성숙한 지방 세포에 가장 가까운 지방 질 유전자 서명을 소유합니다. MAAC를 사용하여, 지방세포는 린 및 비만 환자로부터 배양될 수 있고, 상이한 지방 창고, 상이한 세포 유형과 공동 배양되고, 중요한 것은, 2주 동안 배양될 수 있다. 기능적 실험은 또한 포도당 섭취, 지질 발생 및 지방 분해를 포함한 MAAC에서 수행 될 수있다. 더욱이, MAAC는 다양한 약리학 적인 근치에 강하게 반응하고 갈색 같이 지방 세포로 백색 지방세포의 분신을 포함하여 지방세포 표현형 변경을 공부하는 것을 이용될 수 있습니다.
Introduction
비만과 비만 관련 공동 이환에 있는 세계적인 증가는 새로운 치료의 발달을 필요로 합니다. 백색 지방 조직(WAT)은 전신 대사, 에너지 항상성의 중요한 조절제이며, 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병(T2D)1,2의발달에 중심적인 역할을 한다. 만성 과잉 칼로리 소비 하는 동안, 지방 세포 에너지의 잉여를 처리 하기 위해 확대. 그러나, 지방세포 지질 저장 용량은 초과될 수 있으며, 그 결과 지방산의 순환 수준이 높아지고 말초 비지방 조직에 저장이증가하여 지질중독3,4가이르게 된다.
높은 번역 관련성을 가진 시험관 내 지방세포 모델의 부족은 비만과 T2D를 위한 새로운 처리의 발달에 있는 중요한 도전입니다. 지방 조직의 작은 조각이 배양되는 ex vivo 배식물 모델은 저산소증 및 염증에 의해 구동되는 지방 생성 유전자 발현의 급속한 변경과 관련이 있다5,6. 천장 배양체(CCs)는 성숙한 지방세포가 부유하고 배지로 채워진 플라스크의 상부에 부착되며,지질이결여된 섬유아세포로 급속히 분화되는7,8,9,10. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 체외에서 분화 된 지방세포체입니다. 분화한 세포는, 그러나, 형태학적으로 크기가 훨씬 작고 단엽 지질 물방울이 결여되기 때문에 생체 내에서 성숙한 지방세포와 구별됩니다. 이 모델의 다른 한계는 분화를 유도하기 위한 화학적 칵테일의 비생리학적 필요성뿐만 아니라 다수의 요인11,12,13,14에의해 영향을 받을 수 있는 분화 효율의 가변성을 포함한다.
우리는 최근에 막 성숙 지방 세포 골재 배양 (MAAC), 담포세포가 투과성 막(10)하에서 배양되는 신선하게 분리된 성숙한 지방세포의 장기 배양을 위한 방법을 개발하였다. RNA 염기서열 분석 데이터의 편견 분석은 지방 조직 이식 및 시험관 내 분화 지방세포에 비해 MAAC가 새로 분리된 지방세포와 가장 유사하다는 것을 보여주었다. MAAC는 비만과 마른 과목 모두에서 피하 및 내장 지방 조직 모두에서 분리 성숙한 지방 세포뿐만 아니라 지방 세포체배양에 사용할 수 있습니다. 이 방법론은 장기 지방세포 표현형 변화의 연구를 허용하고 다른 세포 유형과 지방 세포의 공동 배양을 용이하게합니다. 여기에서 우리는 인간 지방 조직에서 성숙한 지방세포의 격리를 위한 상세한 프로토콜 및 MAAC 시스템을 설정하는 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
막 성숙 지방세포 골재 배양(MAAC)은 신선하게 단리된 성숙한 지방세포의 장기 배양을 위한 새로운 방법이다. MAAC를 설정할 때 성숙한 지방세포의 수율, 품질 및 생존에 큰 영향을 미치는 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 단계는 지방세포가 콜라게나아제에 노출되는 시간의 양에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 3.2 단계에서 지방을 다듬기 위해 많은 노력을 기울여야합니다. 지방분의 조각이 너무 큰 경우, 소화 시간은 세포의 생존에 부정적인 영향을 미치는 확장해야합니다. 반대로, 조직이 가위로 너무 미세하게 처리되는 경우에, 생존력은 또한 영향을 받을 수 있습니다. MAAC로 성숙한 지방세포의 성공적인 문화를 위해, 하나는 다음 단계에 특별한주의를 기울여야한다 : 막에 지방 세포의 성공적인 파종을 위해, 그것은 자유 지질 및 이월 세척 버퍼가 성숙한 지방 세포에서 제거하는 것이 중요합니다 5.3 단계와 5.4 단계에서. 남아있는 지질 또는 세척 버퍼는 지방 세포의 표면 장력을 감소시키고 그들이 뒤집을 때 막을 떨어지는 지방 세포의 위험을 증가시킬 것이다. 지방세포가 씨를 뿌리고 매체에 있을 때, 세포는 주로 부력을 통해 막과 접촉하게 되므로 세포를 잃지 않도록 매체를 변경할 때 느리고 부드러운 기술을 권장합니다. 7.1단계에 설명된 대로 우물 바닥에서 용지를 제거하고 벽면 아래로 천천히 매질을 피펫팅하여 매체를 추가합니다. 마지막으로, 시간 절약 제안은 지방 세포 격리 과정 전에 매체 및 치료와 플레이트를 준비하는 것입니다. 특히 복잡한 실험 설계의 경우 플레이트를 미리 준비하면 많은 시간을 절약 할 수 있으며 지방 세포가 분리되는 즉시 처리와 함께 미디어에 배치되도록합니다.
차별화 preadipocytes에 비해 MAAC를 사용하는 한 가지 장점은 사용되는 MAAC 매체가 매우 간단하고 생리호르몬 칵테일을 필요로하지 않는다는 것입니다. 여기에서 우리는 포도당이 풍부한 매체 (DMEM/F12), 10% FBS, 1% 펜/스트렙 및 20 nM 인슐린에 있는 MAAC를 배양했습니다. 중요한 것은, 우리는 인슐린이 UCP110의rosiglitazone/pioglitazone 구동 유도를 위해 절대적으로 필요하다는 것을 것을을 발견했습니다. 인슐린은, 그러나, 세포의 지광 표현형을 유지하기 위하여 요구되지 않습니다. 따라서, 실험적 질문에 따라, 인슐린은 포함되거나 생략될 수 있다.
위에서 자세히 설명한 절차는 인간 지방세포의 고립과 문화에 최적화되어 있습니다. 그러나, 마우스, 그리고 아마도 다른 유기체의 지방세포는, 또한 MAAC로 배양될 수 있습니다. 마우스 지방세포가 MAAC로 배양되는 경우 염두에 두어야 할 추가 고려 사항 및 예방 조치가 있습니다. 우리는 마우스에서 성숙한 지방세포가 인간에게서 그것 보다는 훨씬 더 연약하다는 것을 것을을 발견했습니다. 그 결과, 소화 시간은 세포 생존력을 높이기 위해 절대 최소로 단축되어야합니다. 우리는 또한 젊은 마우스 (8 주 이하)에서 지방 세포가 가장 강력하고 재현 가능한 결과를 제공한다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 마우스 MAAC는 최대 1 주일 동안 배양 될 수 있지만, 그들의 지방 생성 표현형이 인간보다 덜 안정적으로 나타난다는 것을 감안할 때 (적어도 2 주를 통해 배양 될 수 있음) 마우스 MAAC를 최소 필요한 시간 동안 배양하는 것이 좋습니다. 실험적인 질문.
MAAC 모형은 투과성 막을 사용하여 기지를 두기 때문에, 이 기술의 1개의 이점은 그밖 세포 모형과 성숙한 지방세포를 공동 배양하는 가능성입니다. 우리는 이전에 MAAC10의사용을 통해 크로스 토크 성숙한 지방 세포및 대식세포의 능력을 입증했습니다. 이것은 비만, 인슐린 저항 및 면역 반응15,16,17사이 연계를 더 탐구하는 기회를 열어줍니다. 미래 실험은 MAAC 모형의 복잡성 그리고 번역 관련성을 더 증가시키고 다중 세포 모형 사이 교차를 조사하기 위하여 간세포, preadipocytes, 내피 세포, 또는 췌장 세포와 같은 그밖 세포 모형을 통합할 수 있었습니다.
MAAC는 시험관 내 다른 지방세포 모델에 비해 지방세포의 기능 및 정체성을 유지하는 데 탁월한 것으로 나타났지만, 또한 고려해야 할 한계가 있다. 전구체 세포에서 분화 된 지방 세포를 사용하는 데 비해 MAAC는 더 힘들고 시간이 많이 걸리는 모델입니다. 멤브레인이있는 플레이트는 일반 세포 배양 판에 비해 더 비쌉입니다. 중요한 것은, 성숙한 지방세포는 파종시마다 신선하게 분리되어야 하며 전구체 세포와 같은 주식으로 확장되거나 동결될 수 없습니다. 따라서, 이것은 신선한 백색 지방 조직 견본에 접근을 갖는 것을 요구합니다, 그러나 또한 기증자 변이에 기증자에서 유래하는 복잡성의 수준을 추가합니다.
여기에서 우리는 인간 성숙한 지방세포를 격리하고 MAAC를 설치하기 위한 상세한 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 MAAC로 배양 된 지방 세포가 2 주를 통해 실행 가능한 상태로 유지되고, 그들의 지질 유전자 서명이 보존되고, 다양한 약리학 작용에 반응한다는 것을 입증했습니다. MAAC를 사용하면 크로스 토크 betweeen 지방 세포 및 기타 세포 유형의 연구, 그리고 다른 자극에 대한 응답으로 성숙한 지방 세포의 장기 표현형 변화의 평가를 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자원을 제공하고 지방세포 격리를 최적화한 샤오롱 펑과 스테판 할렌, 기술 지원을 위한 마틴 우르봄, 다니엘 올라우손과 마린 론이 인간 지방을 조정하고 제공한 것에 대해 감사를 표한다.
Materials
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
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