利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）的人类成熟腺细胞的分离与培养

在瑞典哥德堡的萨尔格伦斯卡大学医院，从接受选择性手术的女性患者的腹部区域收集了匿名的脂肪组织样本。所有研究对象在书面知情同意使用组织之前，都收到了书面和口头信息。这些研究得到了瑞典哥德堡区域道德审查委员会的批准。 注：图1提供了该方法的概述。 1. 制备缓冲液、组织培养和培养板 在 900 mL 水中溶解 35.1 g 的 NaCl、1.75 g KCl、0.82 g KH2PO4和 1.48 g MgSO4+7H2O，制备 5x 克雷布斯环角 （KR） 库存。加入 1.84 g 的 CaCl2±2H2O，通过加水将音量调节到 1 L。通过 0.22 μm 过滤器进行无菌过滤器，并储存在 4°C 下。 从 5x KR 库存中，制备 1 L 的缓冲液，其中包含 1x KR、25 mM HEPES、2 mM 葡萄糖和 2% 牛血清白蛋白 （BSA）（以下简称洗涤缓冲液）。将 pH 调整到 7.4。 制备含有 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA 和 450 mL 水的胶原酶缓冲液 500 mL（以下简称消化缓冲液）。注：在步骤2.2中称量脂肪组织后，不应将胶原酶添加到消化缓冲液中。 将中等 199 的 pH 度调整为 7.4。 无菌过滤器缓冲液和介质199通过0.22 μm滤瓶加热至37°C。注：为了节省时间，在加工脂肪组织之前，可以准备组织培养培养，并将其添加到板中。对于 24 孔板格式（图 1A），使用 0.5⁄1 mL/孔 Dulbecco 的改良 Eagle 的介质/Ham 的营养混合物 F12 （DMEM/F12）、10% 胎儿牛血清 （FBS）、1% 青霉素-链霉素 （彭/链球菌） 和 20 nM 胰岛素。小分子和其他稳定的药理剂也可以在这个时候添加到介质在所需的布局。将板放入组织培养箱（37°C，5% CO2）。 2. 解剖人体皮下脂肪组织 注：在生物安全柜内工作，在整个隔离过程中使用无菌技术，以及独家使用高压灭菌和无菌设备。 将人体脂肪组织放入15厘米培养皿中，加入少量中等199，使其在解剖过程中保湿。 使用大约高尔夫球大小的脂肪片，用钳子抓住大型纤维化容器，并通过用封闭剪刀的背面刮擦脂肪来轻轻释放脂肪细胞。丢弃大块纤维化组织。称量修剪的脂肪。 3. 胶原酶治疗 将胶原酶加入消化缓冲液（参见步骤1.3），浓度为1mg/mL。使用 0.22 μm 无菌过滤器对溶液进行无菌过滤。注：建议每克脂肪3 mL的消化缓冲液（即，对于100克脂肪，用300mg的2型胶原酶制备300 mL的消化缓冲液）。注意：2型胶原酶对眼睛、皮肤有害，并可能导致呼吸道刺激。处理胶原酶时，请戴上手套、护目并工作在通风罩中工作。 将大约 10 克脂肪组织移动到 15 厘米培养皿中，用一把弯曲的剪刀仔细切碎脂肪，直到它变成平滑的均匀混合物，并且没有大块的脂肪。重复此过程，直到处理所有脂肪。注：每轮大约需要2分钟，脂肪片应足够小，以便可以使用宽孔移液器尖端移液。这一步对于产生高质量的脂肪细胞至关重要。如果碎片太大，消化时间将不得不延长，损害细胞的通力。 使用勺子将切碎的脂肪转移到 50 mL 锥形管中。在每个管中加入10 mL的切碎组织和30 mL的消化缓冲液。如果可用的切碎脂肪量小于 10 mL，则可缩小至适当的体积。 在37°C下在摇动的培养箱中消化组织，在150rpm下持续搅拌30-45分钟。30分钟后，每5分钟检查一次，以避免过度消化。注：当脂肪溶液均匀且没有任何大块且具有杏色时，消化完成。 4. 细胞悬浮物的过滤和成熟蛋白细胞的纯化 将漏斗放在 1 L 无菌烧瓶的顶部，并在漏斗内放置无菌 250 μm 网状过滤器。将消化的脂肪溶液倒入过滤器中，以去除未消化的组织。 当所有的脂肪细胞悬浮液都通过过滤器时，轻轻挤压网状过滤器以增加脂肪细胞的产量。将大约 50~100 mL 的洗涤缓冲液倒入过滤器中冲洗，然后再次挤压滤清器。 将从烧瓶中分离的脂肪悬浮液倒入分离漏斗中，并添加洗涤缓冲液，直到漏斗几乎完全填满。轻轻地反转漏斗几次，将脂肪细胞悬浮液与缓冲液混合。 让悬浮液站立2⁄3分钟，直到有2层的明显分离（图1B），顶部黄色层包含成熟的脂肪细胞和自由脂质，底部层包含缓冲液和脂肪频闪血管分数（SVF）。 打开分离漏斗上的喷嘴，将底部溶液慢慢排入无菌烧瓶（SVF中的细胞可在离心后以200 x g进行7分钟）进行颗粒和收集）。在分离漏斗中保留与成熟脂肪细胞的顶层。 在步骤 4.3_4.5 中重复洗涤过程三次，彻底洗涤成熟的脂肪细胞并去除所有胶原酶。 5. 成熟蛋白细胞的包装 打开喷嘴，将纯化的成熟脂肪细胞悬浮液收集到 50 mL 锥形管中。 通过以 50 x g旋转管 3 分钟，轻轻包装成熟的脂肪细胞。 使用 18 G 针头和注射器去除脂肪细胞悬浮液下方的剩余洗涤缓冲液。 使用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞顶部的游离脂质层（在隔离过程中破裂的一小部分脂肪细胞中的油）。注：为了降低在步骤 6.5 中脂肪细胞从膜上滴出的风险，当成熟的脂肪细胞播种到膜上时，必须去除脂质层和所有洗涤缓冲液。因此，在3个管中收集脂肪细胞。最后收集的样本将具有最多的结转脂质，因此质量最低。但是，通过仔细移液，可以使用这些样品。 6. 成熟蛋白细胞的种子 打开含有渗透膜插入物的包装（材料表），并拿出膜组件。翻转它，并放置在无菌表面，使膜面对天花板。 将30 μL的包装成熟脂肪细胞移液到每个膜上（图1C）。避免用尖端接触膜。使用宽孔移液器吸头将细胞播种，或使用剪刀剪下一小块移液器尖端，使其更宽。 在整个播种过程中，用包装的脂肪细胞多次轻轻反转 50 mL 管，以确保不同尺寸的脂肪细胞均匀分布。 将装有介质的多孔板从培养箱带到生物安全柜，并取下盖子。拿起用脂肪细胞播种的膜，从底部抓住它，以便它可以在步骤6.5中倒置。 在一个平滑的运动中，将膜与顶部的脂肪细胞反转，使种子的脂肪细胞现在朝下（图1D）。将带脂肪细胞的板放入装有介质的孔中（图1E）。 将盖子放在盘子上，小心地将板转移到组织培养箱中。避免板的快速移动，因为最初很容易去除脂肪细胞。注：细胞需要几天才能更牢固地粘附在膜上。 7. 维护脂肪细胞和分析收获 至少每 7 天更换一次媒体。通过每个膜插入件中的切口孔拆下并添加介质。要取出介质，请使用注射器和针头、吸气棒或带 p200 尖端的移液器。要添加介质，请使用移液器，并缓慢地将新媒体移入墙边，以避免干扰脂肪细胞。注： 脂肪细胞已培养 2 周，7 天后更换一次介质。然而，不同的脂肪来源和实验问题可能受益于增加的介质变化。 要收获RNA，如步骤7.1所述，去除培养物，并将500μL的液化缓冲液（材料表）直接加入井中，以对细胞进行分液。要修复细胞进行成像，请以1%的最终浓度将甲醛直接添加到井中。注：然后细胞可以储存在4°C。