Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

Se recogieron muestras anónimas de tejido adiposo de la región abdominal de pacientes femeninas sometidas a cirugía electiva en el Hospital Universitario Sahlgrenska en Gotemburgo, Suecia. Todos los sujetos del estudio recibieron información escrita y oral antes de dar su consentimiento informado por escrito para el uso del tejido. Los estudios fueron aprobados por la Junta Regional de Revisión Etica en Gotemburgo, Suecia. NOTA: En la Figura 1se proporciona información general sobre el método. 1. Preparación de búferes, medios de cultivo de tejidos y placas de cultivo Preparar un stock de 5x Krebbs Ringer (KR) disolviendo 35,1 g de NaCl, 1,75 g de KCl, 0,82 g de KH2PO4y 1,48 g de MgSO4x 7H2O en 900 ml de agua. Añadir 1,84 g de CaCl2x 2H2O y ajustar el volumen a 1 L añadiendo agua. Filtro estéril a través de un filtro de 0,22 m y guárdelo a 4 oC. A partir de la población de 5x KR, prepare 1 L de tampón que contenga 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM de glucosa y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) (denominada en lo sucesivo tampón de lavado). Ajuste el pH a 7.4. Preparar 500 ml de tampón de colagenasa que contenga 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% De BSA y 450 ml de agua (denominado en adelante tampón de digestión).NOTA: La colagenasa no debe añadirse al tampón de digestión hasta después de que el tejido adiposo haya sido pesado en el paso 2.2. Ajuste el pH del Medio 199 a 7.4. Filtro estéril tanto tampones como medio 199 a través de un matraz de filtro de 0,22 m y cálido a 37 oC.NOTA: Para ahorrar tiempo, los medios de cultivo de tejidos se pueden preparar y agregar a las placas antes de procesar el tejido adiposo. Para un formato de placa de 24 pocillos(Figura 1A),utilice 0,5 x 1 ml/pozo de la mezcla de nutrientes kódica/jamón de Dulbecco F12 (DMEM/F12), 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (penn/strep) y 20 nM de insulina. Las moléculas pequeñas y otros agentes farmacológicos estables también se pueden añadir en este momento a los medios de comunicación en el diseño deseado. Colocar las placas en una incubadora de cultivo de tejidos (37 oC, 5% CO2). 2. Disección del tejido adiposo subcutáneo humano NOTA: Trabajar dentro de un armario de seguridad biológica y utilizar la técnica estéril durante todo el proceso de aislamiento, así como el uso exclusivo de equipos autoclavedos y estériles. Colocar el tejido adiposo humano en una placa de petri de 15 cm y añadir un pequeño volumen de medio 199 para mantenerlo hidratado durante la disección. Trabajando con piezas de adiposo aproximadamente del tamaño de una pelota de golf, agarre grandes recipientes fibrosos con pinzas y libere suavemente los adipocitos raspando el adiposo con la parte posterior de las tijeras cerradas. Deseche los trozos grandes de tejido fibroso. Pesar la grasa recortada. 3. Tratamiento de la colagenasa Añadir la colagenasa al tampón de digestión (ver paso 1.3) a una concentración de 1 mg/ml. Filtrar estérilmente la solución utilizando un filtro estéril de 0,22 m.NOTA: Se recomiendan tres ml de tampón de digestión por gramo de grasa (es decir, para 100 g de grasa, preparar 300 ml de tampón de digestión con 300 mg de colagenasa tipo 2).ADVERTENCIA: La colatasa tipo 2 es peligrosa para los ojos, la piel y puede causar irritación respiratoria. Use guantes, protección para los ojos y trabaje en una capucha ventilada cuando manipule la colagenasa. Mover aproximadamente 10 g de tejido adiposo a un plato petri de 15 cm y picar la grasa cuidadosamente usando un par de tijeras curvas hasta que se convierta en una mezcla homogénea suave y no haya grandes trozos de adiposo a la izquierda. Repita el proceso hasta que se haya procesado toda la grasa.NOTA: Cada ronda debe tomar aproximadamente 2 minutos y las piezas adiposas deben ser lo suficientemente pequeñas como para que puedan ser pipeteadas usando una punta de pipeta de diámetro ancho. Este paso es crucial para producir adipocitos de alta calidad. Si las piezas son demasiado grandes, los tiempos de digestión tendrán que extenderse, comprometiendo la viabilidad celular. Transfiera la grasa picada en tubos cónicos de 50 ml con una cuchara. Añadir 10 ml de tejido picado y 30 ml de tampón de digestión a cada tubo. Reduzca la escala a volúmenes apropiados si hay menos de 10 ml de grasa picada disponible. Digerir el tejido a 37oC en una incubadora de agitación con agitación constante a 150 rpm durante 30 x 45 min. Después de 30 minutos, compruebe el proceso cada 5 minutos para evitar la digestión excesiva.NOTA: La digestión se completa cuando la solución adiposa es homogénea sin piezas grandes y tiene un color albaricoque. 4. Filtración de la suspensión celular y purificación de los adipocitos maduros Coloque un embudo encima de un matraz estéril de 1 L y coloque un filtro de malla estéril de 250 m dentro del embudo. Vierta la solución de grasa digerida en el filtro para eliminar el tejido no digerido. Cuando toda la suspensión de adipocitos ha pasado a través del filtro, apriete suavemente el filtro de malla para aumentar el rendimiento de los adipocitos. Vierta aproximadamente 50 x 100 ml de tampón de lavado en el filtro para enjuagarlo y apretar el filtro de nuevo. Vierta la suspensión aislada de adipocitos del matraz en un embudo de separación y agregue el tampón de lavado hasta que el embudo esté casi completamente lleno. Invierta suavemente el embudo unas cuantas veces para mezclar la suspensión de adipocitos con el tampón. Deje reposar la suspensión durante 2 x 3 minutos hasta que haya una separación distinta de 2 capas(Figura 1B),con una capa amarilla superior que contenga los adipocitos maduros y los lípidos libres y una capa inferior que contenga el tampón y la fracción vascular de la estroma adiposa (SVF). Abra la boquilla en el embudo de separación y eluda lentamente la solución inferior en un matraz estéril (las células del SVF se pueden peletizar y recoger después de la centrifugación a 200 x g durante 7 min). Mantenga la capa superior con los adipocitos maduros en el embudo de separación. Repita el proceso de lavado en los pasos 4.3 a 4.5 tres veces para lavar a fondo los adipocitos maduros y eliminar toda la colagenasa. 5. Embalaje de los Adipocitos Maduros Abra la boquilla y recoja la suspensión de adipocitos maduros purificados en tubos cónicos de 50 ml. Empaque ligeramente los adipocitos maduros girando los tubos a 50 x g durante 3 min. Utilice una aguja de 18 G y una jeringa para extraer el tampón de lavado restante debajo de la suspensión del adipocitos. Retire la capa lípido libre (aceite de la pequeña porción de adipocitos que se rompió durante el procedimiento de aislamiento) flotando en la parte superior de los adipocitos maduros mediante el uso de una pipeta.NOTA: Para reducir el riesgo de que los adipocitos goteen las membranas en el paso 6.5, es importante que la capa de lípidos y todo el tampón de lavado se hayan eliminado cuando los adipocitos maduros se siembren en las membranas. Por esta razón recoger los adipocitos en 3 tubos. Las muestras que se recogen en último lugar tendrán el mayor número de lípidos de arrastre y, por lo tanto, serán de la menor calidad. Sin embargo, con el pipeteo cuidadoso se pueden utilizar estas muestras. 6. Sembrado de Adipocitos Maduros Abra el envase que contiene los insertos de membrana permeables(Tabla de materiales)y saque el componente de membrana. Voltéalo al revés y colóquelo sobre una superficie estéril para que las membranas se enfrenten al techo. Pipeta 30 l de adipocitos maduros envasados en cada una de las membranas(Figura 1C). Evite tocar la membrana con la punta. Utilice puntas de pipeta de diámetro ancho para sembrar las células, o utilice tijeras para cortar un pequeño trozo de una punta de pipeta para hacerla más ancha. Invierta suavemente los tubos de 50 ml con adipocitos envasados varias veces a lo largo del proceso de sembración para garantizar una distribución uniforme de adipocitos con diferentes tamaños. Lleve las placas multipocillos preparadas que contienen los medios de la incubadora al gabinete de bioseguridad y retire las tapas. Recoger las membranas sembradas con adipocitos y agarrarlas desde la parte inferior para que pueda ser invertida en el paso 6.5. En un movimiento suave invertir las membranas con los adipocitos en la parte superior para que los adipocitos sembrados ahora están mirando hacia abajo(Figura 1D). Baje la placa con adipocitos en los pocillos que contienen medios(Figura 1E). Coloque la tapa en la placa y transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora de cultivodes tisulares. Evite el movimiento rápido de la placa ya que los adipocitos se pueden desalojar fácilmente inicialmente.NOTA: Las células tardan unos días en adherirse más firmemente a la membrana. 7. Mantenimiento de Adipocitos y Cosecha para Análisis Cambie los medios al menos cada 7 días. Retire y añada medios a través del orificio de corte en cada plaquita de membrana. Para extraer el medio, utilice una jeringa y una aguja, una varita aspiradora o una pipeta con una punta p200. Para añadir medios, utilice una pipeta y pipetee lentamente nuevos medios en los pozos a lo largo del lado de la pared para evitar molestar a los adipocitos.NOTA: Los adipocitos se han cultivado durante 2 semanas con un cambio de medios después de 7 días. Sin embargo, diferentes orígenes adicionales y preguntas experimentales pueden beneficiarse de un aumento de los cambios en los medios de comunicación. Para cosechar el ARN, retire el medio como se describe en el paso 7.1, y agregue 500 l de tampón de lisis(Tabla de materiales)directamente en los pozos para aplicar las células. Para fijar las células para la toma de imágenes, agregue formaldehído directamente al pozo a una concentración final del 1%.NOTA: Las celdas se pueden almacenar a 4 oC.