JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

בידוד ותרבות של האדם Adipocytes בוגרים באמצעות ממברנה מבוגרים תרבויות הצבירה (MAAC)

Published: February 13, 2020
doi:
10.3791/60485
, ,
1Bioscience Metabolism, Research and Early Development, Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), BioPharmaceuticals R&D,AstraZeneca, 2The Lundberg Laboratory for Diabetes Research,University of Gothenburg, 3Wallenberg Centre for Molecular and Translational Medicine,University of Gothenburg

Summary

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות adipocytes האדם בוגרת. כאן אנו מפרטים כיצד לבודד adipocytes מן האדיפוז האנושית וכיצד להגדיר MAAC.

Abstract

שומן לבן (וואט) ממלא תפקיד מרכזי בפיתוח עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2 (T2D). כדי לפתח טיפולים חדשים עבור T2D, רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במודלים adipocyte מתורבת נדרשים. מחקר זה מתאר טכניקה חדשה כדי לבודד ותרבות adipocytes האדם בוגרת. שיטה זו זכאי MAAC (ממברנה בוגרת התרבות הצבירה המצטבר), ולעומת adipocyte אחרים במודלים החוץ-גופית, MAAC בעל חתימת גנים adipoגניים כי הוא הקרוב ביותר לבודד הטריים adipocytes בוגרים. באמצעות MAAC, adipocytes יכול להיות תרבותי מפני חולים רזה ושמנים, מחסני אדיפוז שונים, שיתוף תרבותי עם סוגי תאים שונים, וחשוב מכך, ניתן לשמור בתרבות עבור 2 שבועות. ניסויים פונקציונליים ניתן גם לבצע על MAAC כולל ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ו lipolysis. יתר על כן, maac מגיב מכבש כדי מגוון אגוניזם מגוונות והוא יכול לשמש כדי ללמוד שינויים פנוסטיטוניים של אדיפוציטים, כולל בידול של adipocytes לבן לתוך תאים שומן חום כמו.

Introduction

גידול ברחבי העולם השמנת יתר והשמנת יתר הקשורים שיתוף morbidities מחייבת את התפתחותם של therapeutics חדש. רקמת השומן הלבנה (וואט) היא מווסת חשוב של מטבוליזם הגוף המלא, הומאוסטזיס האנרגיה, והוא שחקן מרכזי בפיתוח עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2 (T2D)1,2. במהלך צריכת קלוריות עודפת כרונית, adipocytes להגדיל כדי להתמודד עם עודף של אנרגיה. עם זאת, יכולת אחסון השומנים adipocyte יכול להיות חריגה, והתוצאה היא העלאת רמות של במחזור שומנים של חומצות שומן מוגברת אחסון ברקמות היקפי לא-אדיפוז ומובילה ליפובי3,4.

חוסר אדיפוציטוטה במודלים של מבחנה עם רלוונטיות טרנסלטיות גבוהה הוא אתגר מפתח בפיתוח טיפולים חדשים להשמנה ו T2D. Vivo לשעבר מודל ההסבר, שבו חתיכות קטנות של רקמה של אדיפוז הם בעלי תרבות, קשורה שינויים מהירים ביטוי גנים adipogenic מונע על ידי היפוקסיה ודלקת5,6. התקרה תרבויות (סמ ק) שם בוגרים adipocytes לצוף לדבוק העליון של מדיה מלא מבחנות, מהיר להבדיל לתוך תאים כמו הפיצוץ לתאי חסר השומנים7,8,9,10. המודל הנפוץ ביותר הוא adipocytes הבדיל מתוך מבחנה מחויבת precursors. התאים הבדיל הם, עם זאת, ברורים מורפולוגית מ adipocytes בוגרת ב vivo מאז הם הרבה יותר קטן בגודל וחסר droplet שומנים בלתי מולקולרית. מגבלות אחרות עם מודל זה כוללות את הצורך הבלתי פיזיולוגי של קוקטייל כימי כדי לנהוג בידול, כמו גם השונות ביעילות בידול אשר יכול להיות מושפע על ידי מספר גורמים11,12,13,14.

פיתחנו לאחרונה ממברנה בוגרת הממברנה התרבות צבירה (MAAC), שיטה לתרבות ארוכת טווח של adipocytes בוגרת מבודדים טריים, שם adipocytes הם תרבותיים תחת ממברנות חדיר10. ניתוח לא משוחד של נתונים ברצף RNA הראו כי ביחס לאקסוצמחים רקמת השומן בתוך מבחנה adipocytes הבדיל, MAAC הוא דומה ביותר adipocytes מבודדים טרי. MAAC ניתן להשתמש בתרבות adipocytes בוגרת מבודדים מרקמות שומן תת עורי והקרביים, כמו גם אדיפוציטים מנושאים שמנים ורזה. מתודולוגיה זו מאפשרת את המחקר של שינויי פנוטיפים לטווח ארוך ומאפשר שיתוף תרבות של adipocytes עם סוגי תאים אחרים. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד של אדיפוציטים בוגרים מרקמת השומן האנושית וכיצד להגדיר את מערכת MAAC.

   

Protocol

דגימות אנונימיות של רקמת אדיפוז נאספו מאזור הבטן של חולי נשים שעברו ניתוח בחירה בבית החולים סאלגרנסקה באוניברסיטת גטבורג, שבדיה. כל נושאי הלימוד קיבלו מידע כתוב ושפה לפני מתן הסכמה מושכלת בכתב לשימוש ברקמה. המחקרים אושרו על ידי הוועדה האתית האזורית בגטבורג, שבדיה. הערה: מבט כולל על השיטה מסופק באיור 1. 1. הכנת מאגרים, מדיה לתרבות רקמות ולוחות תרבות להכין מניות 5x K, מדמין (KR) על ידי המסת 35.1 g של הנרוג, 1.75 g של KCl, 0.82 g של KH2פו4, ו 1.48 g של mgso4· 7h2O בתוך 900 mL של מים. הוסף 1.84 g של CaCl2· 2h2O וכוונן את עוצמת הקול ל 1 ל על ידי הוספת מים. מסנן סטרילי באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c. מהמלאי 5x KR, להכין 1 L של מאגר המכיל 1 x KR, 25 מ”מ HEPES, 2 מ”מ גלוקוז, ו 2% סרום שור (BSA) (המכונה להלן מאגר לשטוף). כוונן את ה-pH ל-7.4. הכינו 500 mL של מאגר קולגן המכיל 1x HBSS + CaCl2 + mgcl2, 2% bsa, ו 450 mL של מים (המכונה להלן מאגר העיכול).הערה: אין להוסיף את הקולגן למאגר העיכול עד לאחר שהרקמה האדיפוז שקלה בשלב 2.2. להתאים את ה-pH של בינונית 199 כדי 7.4. מסנן סטרילי הן מאגרים והן בינונית 199 באמצעות בקבוקון 0.22 יקרומטר מסנן וחמים עד 37 ° c.הערה: כדי לחסוך זמן, ניתן להכין את המדיה של תרבות הרקמה ולהוסיף אותם ללוחות לפני עיבוד הרקמה האדיפוז. עבור תבנית הצלחת 24-הבאר (איור 1א), השתמש 0.5-1 mL/טוב של מדיום שונה של הנשר בינונית/נקניק של התערובת התזונתיים F12 (dmem/F12), 10% סרום בצורת העובר (fbs), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (פן/דלקת) ו 20 אינסולין nM. מולקולות קטנות וסוכני תרופתי יציבים אחרים ניתן גם להוסיף בשלב זה למדיה בפריסה הרצויה. מניחים את הצלחות בחממה לתרבית רקמות (37 ° c, 5% CO2). 2. חיתוך רקמה תת-עורית של האדם הערה: לעבוד בתוך ארון בטיחות ביולוגי ולהשתמש בטכניקה סטרילית לאורך תהליך הבידוד, כמו גם שימוש בלעדי של ציוד אוטומטי וסטרילי. הניחו את רקמת השומן האנושית בצלחת פטרי בגודל 15 ס מ והוסיפו נפח קטן של בינוני 199 כדי לשמור אותו לחות במהלך הניתוח. עבודה עם חתיכות של אדיפוז בערך בגודל כדור גולף, תופסים כלי קיבול גדולים עם מלקחיים ושחררו בעדינות את האדיפוציטים על ידי גירוד האדיפוז עם החלק האחורי של מספריים סגורים. להשליך את חתיכות גדולות של רקמה פיברוטית. . שוקלים את השומן הקצוץ 3. הטיפול בקולגן הוסף קולגן למאגר העיכול (ראה שלב 1.3) בריכוז של 1 מ”ג/mL. המסנן הסטרילי מסנן את הפתרון באמצעות מסנן סטרילי מ0.22 יקרומטר.הערה: שלושה מ ל של מאגר העיכול לכל גרם של שומן מומלץ (כלומר, עבור 100 g של שומן, להכין 300 mL של מאגר העיכול עם 300 mg מסוג 2 הקולגן).התראה: סוג 2 הקולגן הוא מסוכן לעיניים, עור עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה. לבשו כפפות, הגנה מפני עיניים והעובדים במכסה מאוורר בעת טיפול בקולגן. הזיזו כ-10 גרם של רקמת אדיפוז לצלחת באורך 15 ס מ והשומן השמן בזהירות באמצעות זוג מספריים מעוקלים עד שהוא הופך לתערובת הומוגנית חלקה, ואין שום פיסות גדולות של אדיפוז. חזור על התהליך עד שכל השומן יעובד.הערה: כל סיבוב אמור להימשך כ-2 דקות, והחתיכות האדיפוז צריכות להיות קטנות מספיק כדי שיוכלו להיות מעוגלים בעזרת טיפ-פיפטה רחב-משעמם. שלב זה חיוני כדי מניב adipocytes באיכות גבוהה. אם החלקים גדולים מדי, יהיה עליך להאריך את זמני העיכול, ולהתפשר על מועדי התאים. העבר את השומן הטחון לתוך צינורות חרוטיים 50 mL בכפית. הוסיפו 10 מ ל של רקמת בשר טחון ו-30 מ ל של מאגר העיכול לכל צינורית. היקף למטה לאמצעי האחסון המתאימים אם פחות מ-10 מ ל של שומן טחון זמין. מעכלים את הרקמה ב-37 ° c באינקובטור רועד עם עצבנות מתמדת ב-150 סל”ד במשך 30-45 דקות. לאחר 30 דקות, לבדוק את התהליך כל 5 דקות כדי למנוע עיכול.הערה: העיכול מושלם כאשר התמיסה של האדיפוז היא הומוגנית ללא חלקים גדולים ובעלת צבע משמש. 4. סינון השעיית התא וטיהור האדיפוציטים הבוגרות מניחים משפך על גבי בקבוקון 1 L סטרילי ומניחים מסנן רשת מ250 יקרומטר סטרילי בתוך המשפך. יוצקים את התמיסה שומן מתעכל לתוך המסנן כדי להסיר את הרקמה הבלתי מתעכל. כאשר כל ההשעיה adipocyte עבר דרך המסנן, לסחוט בעדינות את מסנן רשת השינוי כדי להגדיל את התשואה של adipocytes. יוצקים כ-50 ל-100 מ ל של מאגר לשטוף לתוך המסנן כדי לשטוף אותו ולסחוט את המסנן שוב. יוצקים את ההשעיה adipocyte מבודד מן הבקבוקון לתוך משפך הפרדה ולהוסיף מאגר לשטוף עד המשפך הוא כמעט מלא לחלוטין. בעדינות להפוך את המשפך כמה פעמים כדי לערבב את ההשעיה adipocyte עם המאגר. תן את ההשעיה לעמוד 2-3 דקות עד שיש הפרדה ברורה של 2 שכבות (איור 1B), עם שכבה צהובה העליון המכיל את adipocytes בוגרת ושומנים בחינם ושכבה תחתונה המכילה את המאגר ואת שבר וסקולרית משתית (svf). פתח את הזרבובית על משפך ההפרדה, ולאט לאט הפתרון התחתון לתוך בקבוקון סטרילי (תאים של SVF יכול להיות מחורץ ונאסף לאחר צנטריפוגה ב 200 x g עבור 7 דקות). שמרו על השכבה העליונה עם האדיפוציטים הבוגרות במשפך ההפרדה. חזור על תהליך הכביסה בשלבים 4.3-4.5 שלוש פעמים כדי לשטוף ביסודיות את adipocytes בוגרת ולהסיר את כל הקולגן. 5. אריזת האדיפוציטים הבוגרות פתח את הזרבובית ולאסוף את ההשעיה המטוהרים בוגרת adipocyte לתוך 50 mL חרוט. בקלות לארוז את adipocytes בוגרת על ידי ספינינג צינורות ב 50 x g עבור 3 דקות. השתמש במחט 18 G ומזרק כדי להסיר את מאגר הכביסה הנותרים מתחת ההשעיה adipocyte. הסר את שכבת השומנים ללא תשלום (שמן מן החלק הקטן של adipocytes שנשברה במהלך הליך הבידוד) צף על גבי adipocytes בוגרת באמצעות פיפטה.הערה: כדי להפחית את הסיכון כי adipocytes יהיה לטפטף את הקרומים בשלב 6.5, חשוב כי שכבת השומנים ואת כל מאגר לשטוף הוסרו כאשר adipocytes בוגרים נזרע הקרומים. מסיבה זו לאסוף את adipocytes ב 3 צינורות. הדגימות שנאספו האחרון יהיה הנושא הטוב ביותר על השומנים ולכן יהיה באיכות הנמוכה ביותר. עם זאת, עם ליטוף זהיר דגימות אלה ניתן להשתמש. 6. זריעה של אדיפוציטים מבוגרות פתח את החבילה המכילה את מוסיף ממברנה חדיר (טבלת חומרים) ולהוציא את רכיב הממברנה. הפוך אותו הפוך והניחו על משטח סטרילי, כך שהממברנות פונות לתקרה. פיפטה 30 μL של אדיפוציטים בוגרים ארוזים על כל הקרומים (איור 1ג). להימנע מלגעת הקרום עם הקצה. השתמשו בטיפים רחבים ומשעממים לזרע את התאים, או להשתמש במספריים כדי לחתוך חתיכה קטנה של קצה של פיפטה כדי להפוך אותו לרחב יותר. בעדינות להפוך את צינורות 50 mL עם מספר adipocytes ארוז כמה פעמים לאורך תהליך הזריעה כדי להבטיח הפצה אפילו של adipocytes עם גדלים שונים. הביאו את הלוחיות המוכנות המכילות את המדיה מהאינקובטור לארון הביובטיחות והסירו את העפעפיים. להרים את הקרום הנזרע עם adipocytes ולתפוס אותו מלמטה, כך שהוא יכול להיות הפוך בשלב 6.5. בתנועה אחת חלקה להפוך את הקרומים עם adipocytes על גבי כך האדיפוציטים הנזרע כעת פונה כלפי מטה (איור 1ד). הנמך את הצלחת עם אדיפוציטים לתוך הבארות המכילות מדיה (איור 1E). שים את המכסה על הצלחת והעבר בזהירות את הצלחת לתוך החממה תרבות רקמות. הימנע תנועה מהירה של הצלחת מאז adipocytes יכול בקלות להיות מעיפה בתחילה.הערה: התאים לוקח כמה ימים כדי לדבוק בחוזקה על הקרום. 7. תחזוקת אדיפוציטים וקציר לניתוח שנה את המדיה לפחות כל 7 ימים. הסר והוסף מדיה דרך חור החיתוך בכל תותב ממברנה. כדי להסיר את המדיה, השתמש במזרק ובמחט, בשרביט משוכן או בפיפטה עם קצה p200. כדי להוסיף מדיה, השתמש בפיפטה ובאיטיות מדיה חדשה לתוך הבארות לאורך הצד של הקיר כדי למנוע הפרעה האדיפוציטים.הערה: Adipocytes כבר מתורבת 2 שבועות עם אחד שינוי המדיה לאחר 7 ימים. עם זאת, מקורות אדיפוז שונים ושאלות נסיוניות עשויות להועיל משינויי מדיה מוגברים. כדי הקציר RNA, להסיר את המדיה כמתואר בשלב 7.1, ולהוסיף 500 μL של מאגר הליזה (טבלת חומרים) ישירות לתוך הבארות כדי להוריד את התאים. כדי לתקן את התאים עבור דימות, להוסיף פורמלדהיד ישירות לבאר בריכוז הסופי של 1%.הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את התאים ב-4 ° c.

Representative Results

Adipocytes מבוגרים תרבותי כמו MAAC שומרת על תפקידם, פנוטיפ, והוא יכול לשמש כדי ללמוד תגובות האדיפוציטים לטיפולים תרופתי שונים. לאחר 1 שבוע של תרבות MAAC מבודדים מרקמת השומן התת עורית לשמור על השומנים מאפיין שומנים בלתי ניתן למצוא רק בוגרים adipocytes (איור 2א). Maac היה תרבותי עבור שבוע אחד בזמן שטופלו עם או PPARγ אגוניסטים רוזיגליטזון (rosi) ו פיוגליטזון (Pio), או קולטן glucocorticoid (GR) דקסמטסון (דקס) כדי לקבוע אם שונים קולטן הורמון גרעיני (nhr) אגוניסטים כונן החזוי שינויים היעד במטה גנים maac. Rosi ו Pio הגדילו את הביטוי של הגנים PPARγ מגיבים FABP4 ו- lpl על-ידי 4 ו-2-3, בהתאמה, ואילו דקסמטסון לא היתה השפעה (איור 2ב). באופן דומה, דקסמטסון מכבש הסיע את הביטוי הגן של הגנים היעד GR apod ו FKBP5 על ידי 13-ו-55 מקפלים בהתאמה, בעוד PPARγ אגוניסטים לא היו אפקטים משמעותיים. הדגמנו בעבר כי האדם מבודדים טריים adipocytes לבן בוגרת יכול לשנות לתוך חום כמו פניטיפ ב MAAC כאשר מטופלים עם Rosi10. A 7 יום טיפול עם Rosi או Pio robu, המושרה את הביטוי הגנטי של שומן חום ספציפי גן UCP1 על ידי קיפול 44-65, כמו גם הגדלת הביטוי של סמן שומן חום PDK4 12-18 קיפול (איור 2ג). איור 1: דיאגרמה חזותית של התקנת MAAC. (א) הכנת מדיום. (ב) בידוד ואריזה של אדיפוציטים בוגרות. (ג) זריעת אדיפוציטים בוגרות על הקרומים. (ד) היפוך ממברנות תוך שמירה על מצורף. (ה) הנמכת הקרומים למדיום ושינוי המדיום. דמות זו שונתה ממזיק ואח ’10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: MAAC שומרת על המראה הבלתי מרוצה באמצעות שבוע אחד ומגיבים לאגגוניזם תרופתי מגוון. (א) נציג של השדה 4x ו 10x תמונות בהירות של maac אחרי שבוע של תרבות. אדיפוציטים בעלי קוטר ממוצע של 100 יקרומטר עם טיפות שומנים גדולות ובלתי ניתן להבחין בקלות. (ב) mrna רמות של גנים היעד PPARγ וקולטן glucocorticoid (GR) היעד גנים maac לאחר 7 ימים של טיפול עם הרכב (vehc), רוזיגליטזון (rosi), פיוגליטזון (Pio), או דקסמטסון (דקס). Rosi, Pio ו-Dex השתמשו כולם בריכוז הסופי של 10 μm. (ג) mrna רמות של גנים חומים שומן מועשר ב maac לאחר 7 ימים של טיפול עם הרכב (vehc), רוזיגליטזון (rosi), פיוגליטזון (Pio), או דקסמטסון (דקס). Rosi, Pio ודקס השתמשו כולם בריכוז הסופי של 10 μM. עבור כל נתוני ביטוי הגנים, השימוש בחלבון כריכת הסיביות (TBP) שימש כבקרת נורמליזציה פנימית. הסטטיסטיקות חושבו באמצעות ANOVA בכיוון אחד עם מבחן ההשוואות המרובות של Tukey. (ממוצע ± SD, n = 3, * p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.    

Discussion

התרבות צבירה בוגרת של הממברנה (MAAC) היא שיטה חדשה לתרבות ארוכת טווח של adipocytes בוגרת מבודדים טריים. בהגדרת MAAC יש כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול אשר משפיע מאוד על התשואה, איכות, ואת הכדאיות של adipocytes בוגרים. מאמץ רב יש לשים לתוך מעטה את השומן בשלב 3.2 מאז שלב זה משפיע ישירות על כמות הזמן האדיפוציטים חשופים לקולגן. אם פיסות האדיפוז גדולות מדי, הזמן לעיכול יהיה חייב להיות מורחב אשר משפיע לרעה על הכדאיות של התאים. לעומת זאת, אם הרקמה מעובדת דק מדי עם מספריים, ניתן לשפיע גם על יכולת הכדאיות. עבור תרבות מוצלחת של adipocytes בוגרים כמו MAAC, אחד צריך לתת תשומת לב מיוחדת לשלבים הבאים: לזריעה מוצלחת של adipocytes על הקרומים, זה חיוני כי השומנים בחינם, על גבי שטיפת המאגר מוסר מן האדיפוציטים הבוגרים בשלבים 5.3 ו-5.4. השומנים הנותרים או לשטוף מאגר תפחית את המתח פני השטח של האדיפוציטים ולהגדיל את הסיכון של adipocytes נוטף-off הקרומים כאשר הם התהפך. כאשר האדיפוציטים הן זריעה ובמדיה, התאים נשארים במגע עם הקרום בעיקר באמצעות ציפה, ולכן טכניקה איטית ועדינה מומלצת בעת שינוי מדיה כדי לא לאבד תאים. הסר מדיה מהחלק התחתון של הבארות כמתואר בשלב 7.1 והוסף מדיה על-ידי ליטוף איטי של מדיה בצידי הקירות. לבסוף, הצעה החסכון הזמן היא להכין את הצלחות עם מדיה וטיפולים לפני תהליך הבידוד האדיפותי. במיוחד עבור עיצובים ניסיוני מורכבים, טרום הכנת הצלחות יכול לחסוך זמן רב ומבטיח כי adipocytes ממוקמים במדיה עם הטיפולים שלהם ברגע שהם מבודדים.

אחד היתרונות של שימוש MAAC לעומת preadipocytes מבדילים היא כי מדיה MAAC בשימוש הוא פשוט מאוד אינו דורש קוקטייל הורמון בלתי פיזיולוגי. כאן יש לנו תרבותי MAAC בתקשורת עשיר גלוקוז (DMEM/F12), 10% FBS, 1% פן/דלקת, ו 20 אינסולין nM. חשוב מכך, מצאנו כי אינסולין נדרש לחלוטין עבור rosiglitazone/פיוגליטאזור מונחה אינדוקציה של UCP110. אינסולין, עם זאת, אינו נדרש כדי לשמור על התאים האדיגניים הפנוטיפים. כך, בהתאם לשאלה הניסיונית, ניתן לכלול או להשמיט אינסולין.

ההליך המפורט לעיל כבר אופטימיזציה עבור בידוד ותרבות של אדיפוציטים אנושיים. עם זאת, עכבר, ואולי adipocytes אחרים של האורגניזם, יכול גם להיות תרבותי כמו MAAC. אם העכבר adipocytes הם להיות מתורבתים כמו MAAC יש שיקולים נוספים ואמצעי זהירות כי יש לזכור. מצאנו כי adipocytes בוגרת מעכברים הם הרבה יותר שברירי מאשר אלה מבני אדם. כתוצאה מכך, יש לתקצר את זמן העיכול למינימום המוחלט כדי להגדיל את הכדאיות בתאים. מצאנו גם כי adipocytes מעכברים צעירים (8-שבוע בן צעיר) סיפק את התוצאות החזקות ביותר הניתנות לספירה. לבסוף, MAAC העכבר יכול להיות תרבותי עד שבוע אחד, עם זאת ניתנה כי הפנוטיפים האדיפוגניים שלהם מופיע פחות יציב מאשר בני אדם (אשר יכול להיות מתורבת באמצעות לפחות שבועיים) אנו ממליצים culturing העכבר MAAC עבור הזמן הנדרש המינימלי לכתובת שאלות נסיוניות.

מאז המודל MAAC מבוסס על שימוש ממברנות חדיר, אחד היתרונות של טכניקה זו היא האפשרות של שיתוף culturing בוגרים adipocytes עם סוגי תאים אחרים. הדגמנו בעבר את היכולת של adipocytes בוגרת מקרופאגים כדי הוצלב באמצעות MAAC10. זה פותח את ההזדמנויות כדי לחקור עוד יותר את הקישור בין השמנת יתר, תנגודת לאינסולין, ותגובות החיסון15,16,17. ניסויים עתידיים יכולים לשלב סוגים אחרים של תאים כגון הפטציטים, preadipocytes, תאי האנדותל, או תאים הלבלב כדי להגדיל עוד יותר את המורכבות ואת הרלוונטיות הטרנסלובותית של המודל MAAC ולחקור הוצלב בין סוגי תאים מרובים.

למרות MAAC הוכח להיות מעולה על שמירה על הפונקציונליות והזהות של adipocytes ביחס adipocyte אחרים במודלים חוץ גופית, יש לו גם מגבלות כי צריך להיחשב. בהשוואה לשימוש adipocytes הבדיל מתוך תאים מקודמן, MAAC הוא מפרך יותר לגזול זמן מודל. צלחות עם ממברנות יקרות אף יותר לעומת לוחיות התרבות הרגילות של התאים. חשוב מכך, adipocytes בוגרים צריך להיות טרי בודד בכל פעם על זריעה ולא ניתן להרחיב או קפוא לתוך המניות כמו תאים מקודמן. לפיכך, הדבר דורש גישה לדגימות של רקמת שומן טריים לבנים, אך גם מוסיפה רמת מורכבות הנובעת מהתורם לווריאציות התורמים.

כאן הצגנו פרוטוקול מפורט לבידוד האדם adipocytes בוגרים והקמת MAAC. הדגמנו כי adipocytes תרבותי כמו MAAC נשאר קיימא במשך שבועיים, החתימה הגנטית האדיגנית שלהם נשמר, והם מגיבים מגוונת של אגוניזם תרופתי. באמצעות MAAC מאפשר ללמוד החוצה לדבר החוצה העין adipocytes וסוגי תאים אחרים, והערכה של שינויים לטווח ארוך פנוטיפים של adipocytes בוגרים בתגובה גירויים שונים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לשאו-רונג פנג ולסטפן האלן על מתן משאבים ואופטימיזציה של הבידוד האדיפוציאני, מרטין אורבום לסיוע טכני, ודניאל אולקסון ומאלין Lönn לתיאום ולמתן האדיפוז האנושית.

Materials

Autoclaved scissors
Autoclaved spoons
Autoclaved tweezers
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A6003
Buffer RLT QIAGEN 79216 Lysis buffer
CaCl2*2H2O Sigma-Aldrich C7902
Conical tubes, 50 mL
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DMEM/F-12 Gibco 31331-028
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10270-106
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm Thermo Scientific 156-4020 500 mL
Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm Thermo Scientific 158-0020 1000 mL
HBSS+CaCl2+MgCl2 Gibco 14065-49
HEPES buffer solution (1M) Gibco 15630-056
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit Applied Biosystems 4368814
Insulin (Actrapid Penfill) Novo Nordisk A/S
KCl Merck 104936
KH2PO4 Merck 104873
Medium 199 Gibco 10012-011
Mesh filter (250 µM) Sintab AB 6111-025043
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich M1880
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Needles, 18G, 1.20×40 mm Sterican 613-2948
Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) Gibco 15140
Petri dishes, 150×21 mm Thermo Scientific 168381
Power SYBR Green PCR master mix Applied Biosystems 4367659
Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine Applied Biosystems
RNeasy Mini kits QIAGEN 74106
Separation funnel VWR 527-0008 For large scale preparation
Separation funnel VWR 527-0005 For small scale preparation
Shaking incubator (37 °C)
Syringes, 5 mL Omnifix 612-2892 100 st
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Transwells, 24-well (6,5 mm) Costar 3397 Permeable membrane inserts
TRIzol reagent Invitrogen 10296010 Lysis buffer
Type 2 Collagenase Worthington LS004177
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Lotta, L. A., et al. Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance. Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).
  4. Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. Insulin resistance and impaired adipogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).
  5. Gesta, S., et al. Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression. Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).
  6. Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).
  7. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).
  8. Asada, S., et al. Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).
  9. Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).
  10. Harms, M. J., et al. Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  11. Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
  12. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding adipocyte differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  13. Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).
  14. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  15. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).
  16. Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease. The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).
  17. Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. An Integrated View of Immunometabolism. Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).

Tags

Mature AdipocyteAdipocyte CultureMembrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)Adipose BiologyDiabetesObesityCell InteractionsAdipocyte IsolationAdipocyte SuspensionAdipocyte WashAdipocyte Separation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC). J. Vis. Exp. (156), e60485, doi:10.3791/60485 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image