Isolation und Kultur der menschlichen Reife Adipozyten mit Membran Reife Adipozyten Aggregatkulturen (MAAC)

Anonyme Proben von Fettgewebe wurden aus der Bauchregion weiblicher Patienten entnommen, die sich einer Elektive-Operation im Universitätskrankenhaus Sahlgrenska in Göteborg, Schweden, unterziehen. Alle Studienteilnehmer erhielten schriftliche und mündliche Informationen, bevor sie schriftlich ihre Einwilligung zur Verwendung des Gewebes erteilten. Die Studien wurden vom Regional Ethical Review Board in Göteborg, Schweden, genehmigt. ANMERKUNG: Eine Übersicht über die Methode finden Sie in Abbildung 1. 1. Vorbereitung von Puffern, Tissue Culture Media und Kulturplatten Bereiten Sie einen 5x Krebbs Ringer (KR) Vorrat vor, indem Sie 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4und 1,48 g MgSO47H2O in 900 ml Wasser auflösen. Fügen Sie 1,84 g CaCl2,2H2O hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 1 L ein, indem Sie Wasser hinzufügen. Sterilfilter durch einen 0,22-mm-Filter und bei 4 °C lagern. Aus dem 5x KR-Bestand 1 L Puffer mit 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM Glukose und 2% Rinderserumalbumin (BSA) (nachfolgend als Waschpuffer bezeichnet) zubereiten. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie 500 ml Kollagenasepuffer vor, der 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2, 2% BSA und 450 ml Wasser enthält (nachfolgend als Verdauungspuffer bezeichnet).HINWEIS: Die Kollagenase sollte dem Verdauungspuffer erst nach dem Wiegen des Fettgewebes in Schritt 2.2 zugesetzt werden. Stellen Sie den pH-Wert von Medium 199 auf 7.4 ein. Sterilfilter sowohl Puffer als auch mittlere 199 durch einen 0,22 m Filterkolben und warm auf 37 °C.HINWEIS: Um Zeit zu sparen, können die Gewebekulturmedien vorbereitet und platten hinzugefügt werden, bevor das Fettgewebe verarbeitet wird. Für ein 24-Well-Plattenformat (Abbildung 1A) verwenden Sie 0,5 x 1 ml/Gut von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Schinken-Nährstoffgemisch F12 (DMEM/F12), 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin (Penn/Strepmycin) und 20 nM Insulin. Kleine Moleküle und andere stabile pharmakologische Wirkstoffe können zu diesem Zeitpunkt auch den Medien im gewünschten Layout zugesetzt werden. Legen Sie die Platten in einen Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5%CO2). 2. Zerlegung des subkutanen Adipäsösen Fettgewebes HINWEIS: Arbeiten Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank und verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Isolationsprozesses sowie die ausschließliche Verwendung von autoklavierten und sterilen Geräten. Legen Sie das menschliche Fettgewebe in eine 15 cm Petrischale und fügen Sie ein kleines Volumen von medium 199 hinzu, um es während der Zerlegung mit Feuchtigkeit zu befeuchten. Arbeiten Mit Fettstücken ungefähr so groß wie ein Golfball, greifen Sie große fibrotische Gefäße mit Pinzette und lösen Sie sanft die Adipozyten, indem Sie den Fett mit dem Rücken der geschlossenen Schere kratzen. Entsorgen Sie die großen Stücke von fibrotischem Gewebe. Wiegen Sie das getrimmte Fett. 3. Collagenase Behandlung Fügen Sie Kollagennase in den Verdauungspuffer (siehe Schritt 1.3) mit einer Konzentration von 1 mg/ml hinzu. Steriler Filter der Lösung mit einem 0,22 m sterilen Filter.HINWEIS: Es wird empfohlen, drei ml Verdauungspuffer pro Gramm Fett zu verwenden (d. h. für 100 g Fett 300 ml Verdauungspuffer mit 300 mg Typ-2-Kollagenase vorbereiten).VORSICHT: Typ 2 Kollagenase ist gefährlich für Augen, Haut und kann Atemwegsreizungen verursachen. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und arbeiten Sie in einer belüfteten Kapuze, wenn Sie mit der Kollagenase umgehen. Bewegen Sie ca. 10 g Fettgewebe in eine 15 cm Petrischale und zerkleinern Sie das Fett vorsichtig mit einer gekrümmten Schere, bis es zu einer glatten homogenen Mischung wird und keine großen Fettstücke mehr vorhanden sind. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte Fett verarbeitet ist.HINWEIS: Jede Runde sollte ca. 2 min dauern und die Fettstücke sollten klein genug sein, damit sie mit einer Breitbohrpipettenspitze pipettiert werden können. Dieser Schritt ist entscheidend, um qualitativ hochwertige Adipozyten hervorzubringen. Wenn die Stücke zu groß sind, müssen die Verdauungszeiten verlängert werden, wodurch die Zellüberbeinen beeinträchtigt werden. Das gehackte Fett mit einem Löffel in 50 ml konische Schläuche geben. Fügen Sie 10 ml Hackfleisch und 30 ml Verdauungspuffer in jedes Rohr. Skalieren Sie auf geeignete Mengen, wenn weniger als 10 ml gehacktes Fett verfügbar ist. Verdauen Sie das Gewebe bei 37 °C in einem Schüttelinkubator mit konstanter Rührung bei 150 Umdrehungen pro Minute für 30 bis 45 min. Nach 30 min, überprüfen Sie den Prozess alle 5 min, um eine Überverdauung zu vermeiden.HINWEIS: Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die Fettlösung homogen ist, ohne große Stücke und hat eine Aprikosenfarbe. 4. Filtration der Zellsuspension und Reinigung der reifen Adipozyten Legen Sie einen Trichter auf einen 1 L sterilen Kolben und legen Sie einen sterilen 250 m Netzfilter in den Trichter. Gießen Sie die verdaute Fettlösung in den Filter, um das unverdaute Gewebe zu entfernen. Wenn die gesamte Adipozytensuspension durch den Filter gegangen ist, drücken Sie vorsichtig den Netzfilter, um die Ausbeute von Adipozyten zu erhöhen. Gießen Sie ca. 50 x 100 ml Waschpuffer in den Filter, um ihn zu spülen und den Filter erneut zu drücken. Die isolierte Adipozytensuspension aus dem Kolben in einen Trenntrichter gießen und Waschpuffer hinzufügen, bis der Trichter fast vollständig gefüllt ist. Um den Trichter ein paar Mal vorsichtig umzukehren, um die Adipozytensuspension mit dem Puffer zu mischen. Lassen Sie die Suspension für 2 x 3 min stehen, bis es eine deutliche Trennung von 2 Schichten (Abbildung 1B), mit einer oberen gelben Schicht enthält die reifen Adipozyten und freie Lipid und eine untere Schicht enthält den Puffer und die Fettstroma Gefäßfraktion (SVF). Öffnen Sie die Düse am Trenntrichter und heben Sie die Bodenlösung langsam in einen sterilen Kolben (Zellen aus dem SVF können nach zentrifugieren bei 200 x g für 7 min pelletiert und gesammelt werden). Bewahren Sie die obere Schicht mit den reifen Adipozyten im Trenntrichter auf. Wiederholen Sie den Waschvorgang in den Schritten 4.3 x 4.5 dreimal, um die reifen Adipozyten gründlich zu waschen und die gesamte Kollagenase zu entfernen. 5. Verpackung der Reifen Adipozyten Öffnen Sie die Düse und sammeln Sie die gereinigte reife Adipozytensuspension in 50 ml konische Rohre. Die reifen Adipozyten leicht verpacken, indem Sie die Rohre bei 50 x g für 3 min drehen. Verwenden Sie eine 18 G Nadel und eine Spritze, um den verbleibenden Waschpuffer unterhalb der Adipozytensuspension zu entfernen. Entfernen Sie die freie Lipidschicht (Öl aus dem kleinen Teil der Adipozyten, die während des Isolationsvorgangs brach) schwebend auf den reifen Adipozyten mit einer Pipette.HINWEIS: Um das Risiko zu verringern, dass die Adipozyten in Schritt 6.5 von den Membranen abtropfen, ist es wichtig, dass die Lipidschicht und der gesamte Waschpuffer entfernt wurden, wenn die reifen Adipozyten auf Membranen ausgesät werden. Aus diesem Grund sammeln Sie die Adipozyten in 3 Röhren. Die Proben, die zuletzt gesammelt werden, haben die meisten Übertragslipide und sind daher von der niedrigsten Qualität. Bei sorgfältiger Pipettierung können diese Proben jedoch verwendet werden. 6. Aussaat von reifen Adipozyten Öffnen Sie die Verpackung mit den durchlässigen Membraneinsätzen (Materialtabelle) und nehmen Sie die Membrankomponente heraus. Drehen Sie es auf den Kopf und legen Sie es auf eine sterile Oberfläche, so dass die Membranen zur Decke. Pipette 30 l verpackte reife Adipozyten auf jede der Membranen (Abbildung 1C). Vermeiden Sie es, die Membran mit der Spitze zu berühren. Verwenden Sie Breitbohrpipettenspitzen, um die Zellen auszusäen, oder schneiden Sie mit einer Schere ein kleines Stück einer Pipettenspitze ab, um sie breiter zu machen. Um die 50 ml-Rohre mit verpackten Adipozyten während des gesamten Säprozesses vorsichtig umzukehren, um eine gleichmäßige Verteilung von Adipozyten in verschiedenen Größen zu gewährleisten. Bringen Sie die vorbereiteten Multiwell-Platten mit den Medien aus dem Inkubator in den Biosicherheitsschrank und entfernen Sie die Deckel. Nehmen Sie die mit Adipozyten gesäten Membranen auf und greifen Sie sie von unten, so dass sie in Schritt 6.5 invertiert werden können. In einer glatten Bewegung die Membranen mit den Adipozyten oben umkehren, so dass die gesäten Adipozyten nun nach unten gerichtet sind (Abbildung 1D). Senken Sie die Platte mit Adipozyten in die Medienbrunnen (Abbildung 1E). Legen Sie den Deckel auf die Platte und übertragen Sie die Platte vorsichtig in einen Inkubator der Gewebekultur. Vermeiden Sie eine schnelle Bewegung der Platte, da Adipozyten zunächst leicht entfernt werden können.HINWEIS: Es dauert ein paar Tage, bis die Zellen fester an der Membran haften. 7. Wartung von Adipozyten und Ernte zur Analyse Wechseln Sie die Medien mindestens alle 7 Tage. Entfernen und fügen Sie Medien über das Ausschnittloch in jedem Membraneinsatz hinzu. Um die Medien zu entfernen, verwenden Sie eine Spritze und eine Nadel, einen Saugstab oder eine Pipette mit einer p200-Spitze. Um Medien hinzuzufügen, verwenden Sie eine Pipette und langsam Pipette neue Medien in die Brunnen entlang der Seite der Wand, um zu vermeiden, stören die Adipozyten.HINWEIS: Adipozyten wurden seit 2 Wochen mit einem Medienwechsel nach 7 Tagen kultiviert. Unterschiedliche Fettherkunften und experimentelle Fragen können jedoch von zunehmenden Medienveränderungen profitieren. Um RNA zu ernten, entfernen Sie die Medien wie in Schritt 7.1 beschrieben, und fügen Sie 500 L Lysepuffer (Tabelle der Materialien) direkt in die Brunnen, um die Zellen zu lysieren. Um die Zellen für die Bildgebung zu fixieren, fügen Sie Formaldehyd direkt in den Brunnen mit einer Endkonzentration von 1% hinzu.HINWEIS: Die Zellen können dann bei 4 °C gelagert werden.