Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

Anonieme monsters van vetweefsel werden verzameld uit de buikstreek van vrouwelijke patiënten die een electieve operatie ondergingen in het Sahlgrenska University Hospital in Göteborg, Zweden. Alle proefpersonen ontvingen schriftelijke en mondelinge informatie alvorens schriftelijke geïnformeerde toestemming te geven voor het gebruik van het weefsel. De studies werden goedgekeurd door de Regionale Ethische Toetsingsraad in Göteborg, Zweden. OPMERKING: Een overzicht van de methode is opgenomen in figuur 1. 1. Voorbereiding van buffers, weefselcultuurmedia en cultuurplaten Bereid een 5x Krebbs Ringer (KR) voorraad door het oplossen van 35,1 g NaCl, 1,75 g KCl, 0,82 g KH2PO4,en 1,48 g mgso4·7H2O in 900 mL water. Voeg 1,84 g CaCl2·2H2O toe en pas het volume aan op 1 L door water toe te voegen. Steriel filter door een 0,22 μm-filter en bewaar bij 4 °C. Bereid uit de 5x KR-voorraad 1 L buffer voor met 1x KR, 25 mM HEPES, 2 mM glucose en 2% runderserumalbumine (BSA) (hierna “wasbuffer” genoemd). Pas de pH aan op 7,4. Bereid 500 mL collageenase buffer met 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2,2% BSA, en 450 mL water (hierna aangeduid als vergistingsbuffer).OPMERKING: De collageen mag pas aan de vergistingsbuffer worden toegevoegd nadat het vetweefsel in stap 2.2 is gewogen. Pas de pH van Medium 199 aan op 7,4. Steriel filter zowel buffers als medium 199 door middel van een filterkolf van 0,22 μm en warm tot 37 °C.OPMERKING: Om tijd te besparen, kunnen de weefselkweekmedia worden voorbereid en aan platen worden toegevoegd voordat het vetweefsel wordt verwerkt. Gebruik voor een 24-well plaatformaat (figuur 1A), 0,5−1 mL/put van Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium/Ham’s voedingsmengsel F12 (DMEM/F12), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (penn/strep) en 20 nM insuline. Kleine moleculen en andere stabiele farmacologische middelen kunnen op dit moment ook in de gewenste lay-out aan de media worden toegevoegd. Plaats de platen in een weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2). 2. Dissectie van menselijk onderhuids vetweefsel OPMERKING: Werk binnen een biologische veiligheidskast en gebruik steriele techniek gedurende het isolatieproces, evenals exclusief gebruik van autoclaved en steriele apparatuur. Plaats het menselijke vetweefsel in een petrischaal van 15 cm en voeg een klein volume medium 199 toe om het gehydrateerd te houden tijdens de dissectie. Werken met stukken vet ongeveer de grootte van een golfbal, pak grote vezelachtige vaten met pincet en laat de adipocyten voorzichtig los door de vetmaag te schrapen met de achterkant van de gesloten schaar. Gooi de grote stukken vezelig weefsel weg. Weeg het bijgesneden vet. 3. Collagenase Behandeling Voeg collageen ase toe aan de spijsverteringsbuffer (zie stap 1.3) bij een concentratie van 1 mg/mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een 0,22 μm steriel filter.OPMERKING: Drie mL vergistingsbuffer per gram vet wordt aanbevolen (d.w.z. voor 100 g vet, bereid 300 mL vergistingsbuffer voor met 300 mg collageen van type 2).LET OP: Type 2 Collagenase is gevaarlijk voor ogen, huid en kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Draag handschoenen, oogbescherming, en werk in een geventileerde kap bij het hanteren van de collageenase. Beweeg ongeveer 10 g vetweefsel naar een petrischaal van 15 cm en hak het vet voorzichtig af met behulp van een gebogen schaar totdat het een glad homogeen mengsel wordt en er geen grote stukken vet meer over zijn. Herhaal het proces totdat al het vet is verwerkt.OPMERKING: Elke ronde moet ongeveer 2 min duren en de vetstukken moeten klein genoeg zijn, zodat ze kunnen worden gepipettteerd met behulp van een breed-boring pipet tip. Deze stap is cruciaal voor het opleveren van hoge kwaliteit adipocyten. Als de stukken te groot zijn, zullen de verteringstijden moeten worden verlengd, waardoor de celviabilty in gevaar komt. Breng het gehaktvet met een lepel in 50 mL conische buizen. Voeg 10 mL gehakt weefsel en 30 mL spijsverteringsbuffer toe aan elke buis. Schaal naar de juiste volumes als er minder dan 10 mL gehakt vet beschikbaar is. Vermeer het weefsel bij 37 °C in een schuddende couveuse met constante agitatie bij 150 rpm gedurende 30−45 min. Controleer na 30 min het proces om de 5 min om oververte ring te voorkomen.LET OP: De spijsvertering is compleet wanneer de vetoplossing homogeen is zonder grote stukken en een abrikozenkleur heeft. 4. Filtratie van de celsuspensie en zuivering van de volwassen adipocyten Plaats een trechter bovenop een steriele kolf van 1 L en plaats een steriel 250 μm meshfilter in de trechter. Giet de verteerde vetoplossing in het filter om het onverteerd weefsel te verwijderen. Wanneer alle adipocyte nuspensie door het filter is gegaan, knijp je voorzichtig in het mesh-filter om de opbrengst van adipocyten te verhogen. Giet ongeveer 50−100 mL wasbuffer in het filter om het te spoelen en knijp het filter opnieuw. Giet de geïsoleerde adipocyte suspensie uit de kolf in een scheidingstrechter en voeg wasbuffer toe totdat de trechter bijna volledig gevuld is. Keer de trechter een paar keer voorzichtig om de adipocyte suspensie met de buffer te mengen. Laat de suspensie 2−3 min staan tot er een duidelijke scheiding van 2 lagen(figuur 1B),met een bovenste gele laag met de volwassen adipocyten en vrije lipide en een onderste laag met de buffer en de vetlijn stroma vasculaire fractie (SVF). Open het mondstuk op de scheidingstrechter en elute de bodemoplossing langzaam in een steriele kolf (cellen uit de SVF kunnen na centrifugatie worden gepelleteerd en verzameld op 200 x g voor 7 min). Houd de bovenste laag met de volwassen adipocyten in de scheidingstrechter. Herhaal het wasproces in stappen 4.3−4.5 drie keer om de volwassen adipocyten grondig te wassen en alle collageen te verwijderen. 5. Verpakking van de volwassen adipocyten Open het mondstuk en verzamel de gezuiverde volwassen adipocyte suspensie in 50 mL conische buizen. Pak de volwassen adipocyten licht in door de buizen 3 min op 50 x g te draaien. Gebruik een naald van 18 G en een spuit om de resterende wasbuffer onder de adipocytessussus te verwijderen. Verwijder de vrije lipidelaag (olie uit het kleine gedeelte van adipocyten die tijdens de isolatieprocedure brak) drijvend bovenop de rijpe adipocyten met behulp van een pipet.OPMERKING: Om het risico te verminderen dat de adipocyten in stap 6.5 van de membranen zullen druppelen, is het belangrijk dat de lipidelaag en alle wasbuffer zijn verwijderd wanneer de volwassen adipocyten op membranen worden gezaaid. Om deze reden verzamelen de adipocyten in 3 buizen. De monsters die als laatste worden verzameld, hebben de meeste overdrachtslipiden en zijn daarom van de laagste kwaliteit. Echter, met zorgvuldige pipetteren deze monsters kunnen worden gebruikt. 6. Zaaien van volwassen adipocyten Open de verpakking met de doorlatende membraaninserts(Tabel met materialen)en haal de membraancomponent eruit. Draai het ondersteboven en plaats op een steriel oppervlak, zodat de membranen het plafond onder ogen zien. Pipetteer 30 μL verpakte volwassen adipocyten op elk van de membranen (figuur 1C). Raak het membraan niet aan met de punt. Gebruik breed-boring pipet tips om de cellen zaad, of gebruik schaar af te snijden een klein stukje van een pipet tip om het breder te maken. Voorzichtig omkeren van de 50 mL buizen met verpakt adipocyten meerdere malen tijdens het zaaiproces om een gelijkmatige verdeling van adipocyten met verschillende maten te garanderen. Breng de geprepareerde multiwell platen met de media van de couveuse naar de bioveiligheidskast en verwijder de deksels. Pak de membranen gezaaid met adipocyten en pak het van de bodem, zodat het kan worden omgekeerd in stap 6.5. In een vloeiende beweging omkeren van de membranen met de adipocyten op de top, zodat de gezaaide adipocyten zijn nu naar beneden (Figuur 1D). Laat de plaat met adipocyten zakken in de putten met media (figuur 1E). Leg het deksel op de plaat en breng de plaat voorzichtig over in een weefselkweekincubator. Vermijd een snelle beweging van de plaat, omdat adipocyten gemakkelijk kunnen worden losgemaakt in eerste instantie.OPMERKING: Het duurt een paar dagen voor de cellen om steviger hechten aan het membraan. 7. Onderhoud van Adipocyten en oogsten voor analyse Verander de media ten minste om de 7 dagen. Verwijder en voeg media toe via het uitsparingsgat in elke membraanwisselplaat. Om de media te verwijderen, gebruik een spuit en een naald, een aspirating wand, of een pipet met een p200 tip. Om media toe te voegen, gebruik maken van een pipet en langzaam pipet nieuwe media in de putten langs de zijkant van de muur om te voorkomen dat het verstoren van de adipocyten.LET OP: Adipocyten zijn gekweekt voor 2 weken met een media-verandering na 7 dagen. Verschillende adipose oorsprong en experimentele vragen kunnen echter baat hebben bij toegenomen veranderingen in de media. Om RNA te oogsten, verwijdert u de media zoals beschreven in stap 7.1 en voegt u 500 μL lysisbuffer(Tabel met materialen)direct toe in de putten om de cellen te lyseren. Om de cellen voor beeldvorming te repareren, voeg formaldehyde direct toe aan de put bij een eindconcentratie van 1%.LET OP: De cellen kunnen vervolgens bij 4 °C worden opgeslagen.