عزل وثقافة الخلايا التحمية الناضجة البشرية باستخدام الثقافات الكلية للأغشية الناضجة (MAAC)
Summary
الثقافة الكلية للغشاء الأوّلي الكلّي (MAAC) هي طريقة جديدة لاستزراع الخلايا الشحمية البشرية الناضجة. هنا نحن بالتفصيل كيفية عزل الخلايا الدهنية من الدهنية الإنسان وكيفية إعداد MAAC.
Abstract
الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) dysregulation يلعب دورا مركزيا في تطوير مقاومة الأنسولين ومرض السكري من النوع 2 (T2D). لتطوير علاجات جديدة لT2D، وهناك حاجة إلى نماذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر الدهني. تصف هذه الدراسة تقنية جديدة لعزل وثقافة الخلايا الشحمية البشرية الناضجة. هذا الأسلوب هو عنوان MAAC (غشاء الناضجة الثقافة الأعلى adipocyte) ، وبالمقارنة مع غيرها من الخلايا الدهنية في نماذج المختبر ، MAAC تمتلك توقيع الجينات adipogenic التي هي الأقرب إلى الخلايا التخلايا الناضجة المعزولة حديثا. باستخدام MAAC ، يمكن استزراع الخلايا الشحمية من المرضى الهزيلين والبدناء ، ومستودعات الدهنية المختلفة ، والمشاركة في الاستزراع مع أنواع الخلايا المختلفة ، والأهم من ذلك ، يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لمدة أسبوعين. ويمكن أيضا إجراء التجارب الوظيفية على MAAC بما في ذلك امتصاص الجلوكوز، وlipogenesis، وتحلل الدهون. وعلاوة على ذلك، يستجيب MAAC بقوة إلى الآلام الدوائية المتنوعة ويمكن استخدامها لدراسة التغيرات الدهنية فينوتبيك، بما في ذلك تمايز الخلايا الدهنية البيضاء إلى خلايا دهنية تشبه البني.
Introduction
وتستلزم الزيادة العالمية في الأمراض المشتركة المرتبطة بالسمنة والسمنة استحداث علاجات جديدة. الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) هو منظم مهم لعملية التمثيل الغذائي في الجسم كله، وتوازن الطاقة، وهو لاعب مركزي في تطوير مقاومة الأنسولين ومرض السكري من النوع 2 (T2D)1،2. أثناء استهلاك السعرات الحرارية الزائدة المزمنة، تتضخم الخلايا الشحمية للتعامل مع فائض الطاقة. ومع ذلك ، يمكن أن تصبح تتجاوز قدرة تخزين الدهون الدهنية ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات تعميم الأحماض الدهنية وزيادة التخزين في الأنسجة الطرفية غير الدهنية ويؤدي إلى سمية الدهون3،4.
عدم وجود نماذج adipocyte في المختبر مع أهمية عالية الترجمة هو التحدي الرئيسي في تطوير علاجات جديدة للسمنة وT2D. نموذج explant explant exvo السابق ، حيث يتم استزراع قطع صغيرة من الأنسجة الدهنية ، يرتبط بالتعديلات السريعة في التعبير الجيني المبوع مدفوعًا بنقص الأكسجة والالتهاب5،6. الثقافات السقف (CCs) حيث الخلايا الشحمية ناضجة تطفو وتتمسك بالجزء العلوي من قوارير مملوءة بالوسائط، وdedifferentiate بسرعة إلى خلايا تشبه الخلايا الليفية تفتقر إلى الدهون7،8،9،10. النموذج الأكثر استخداما هو الخلايا الشحمية المتمايزة في المختبر من السلائف الملتزمة. ومع ذلك، فإن الخلايا المتمايزة متميزة شكلياً عن الخلايا الشحمية الناضجة في الجسم الحي لأنها أصغر بكثير في الحجم وتفتقر إلى قطرة دهنية أحادية. وتشمل القيود الأخرى مع هذا النموذج الحاجة غير الفسيولوجية من كوكتيل الكيميائية لدفع التمايز، فضلا عن التباين في كفاءة التمايز التي يمكن أن تتأثر بعدد من العوامل11،12،13،14.
لقد قمنا مؤخرًا بتطوير الثقافة المجمعة للغشاء الناضج (MAAC) ، وهي طريقة لثقافة طويلة الأجل من الخلايا الشحمية الناضجة المعزولة حديثًا ، حيث يتم استزراع الخلايا الشحمية تحت أغشية نفاذة10. وقد أظهر التحليل غير المتحيز لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أن نسبة إلى النباتات الدهنية الدهنية والدهنية المتمايزة في المختبر ، MAAC هي الأكثر تشابهًا مع الخلايا الدهنية المعزولة حديثًا. يمكن استخدام MAAC لثقافة الخلايا الدهنية الناضجة المعزولة عن الأنسجة الدهنية تحت الجلد والحشوية على حد سواء ، وكذلك الخلايا الشحمية من كل من الموضوعات البدينة والهزيلة. تسمح هذه المنهجية بدراسة التغيرات الدهنية طويلة الأجل وتسهل الثقافة المشتركة للخلايا الشحمية مع أنواع الخلايا الأخرى. هنا نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الشحمية الناضجة من الأنسجة الدهنية البشرية وكيفية إنشاء نظام MAAC.
Protocol
Representative Results
Discussion
الثقافة الكلية للغشاء المثل (MAAC) هي طريقة جديدة للثقافة طويلة الأجل للخلايا التأنية الناضجة المعزولة حديثًا. في إنشاء MAAC هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي تؤثر بشكل كبير على العائد والجودة والقدرة على البقاء من الخلايا الشحمية ناضجة. وينبغي أن يوضع الكثير من الجهد في التشبيب الدهون في الخطوة 3.2 منذ هذه الخطوة يؤثر مباشرة على مقدار الوقت يتعرض الخلايا الشحمية إلى الكولاجين. إذا كانت قطع الدهنية كبيرة جدا، فإن وقت الهضم يجب أن تمتد مما يؤثر سلبا على قدرة الخلايا على البقاء. على العكس من ذلك ، إذا تمت معالجة الأنسجة بدقة كبيرة مع مقص ، يمكن أن تتأثر القدرة على البقاء أيضًا. لثقافة ناجحة من الخلايا الشحمية الناضجة كما MAAC، ينبغي للمرء أن يعطي اهتماما خاصا للخطوات التالية: لالبذر الناجح للخلايا الشحمية على الأغشية، فمن الأهمية بمكان أن الدهون الحرة وترحيل غسل العازلة تتم إزالة من الخلايا الدهنية ناضجة في الخطوات 5.3 و 5.4. الدهون المتبقية أو غسل العازلة سوف يقلل من التوتر السطحي للadipocytes وزيادة خطر الخلايا الشحمية يقطر قبالة الأغشية عندما يتم قلبها. عندما يتم بذر الخلايا الشحمية وفي وسائل الإعلام ، تبقى الخلايا على اتصال مع الغشاء في المقام الأول من خلال الطفو ، وبالتالي يوصى بتقنية بطيئة ولطيفة عند تغيير الوسائط لعدم فقدان الخلايا. إزالة وسائل الإعلام من أسفل الآبار كما هو موضح في الخطوة 7.1 وإضافة وسائل الإعلام عن طريق الأنابيب ببطء وسائل الإعلام أسفل جانبي الجدران. وأخيرا، اقتراح توفير الوقت هو إعداد لوحات مع وسائل الإعلام والعلاجات قبل عملية عزل الخلايا الشحمية. خاصة بالنسبة للتصاميم التجريبية المعقدة ، يمكن أن يوفر الإعداد المسبق للأطباق الكثير من الوقت ويضمن وضع الخلايا الشحمية في الوسائط مع علاجاتها بمجرد عزلها.
فائدة واحدة من استخدام MAAC مقارنة مع التمييز preadipocytes هو أن وسائل الإعلام MAAC المستخدمة بسيطة جدا ولا تتطلب كوكتيل هرمون غير فسيزيولوجية. هنا لدينا ثقافة MAAC في وسائل الإعلام الغنية بالجلوكوز (DMEM/F12)، 10٪ FBS، 1٪ بنسلفانيا / العقدية، و 20 nM الأنسولين. الأهم من ذلك، وجدنا أن الأنسولين مطلوب تماما لrosiglitazone / pioglitazone مدفوعة تحريض UCP110. الأنسولين، ومع ذلك، ليست مطلوبة للحفاظ على النمط الظاهري الخلايا adipogenic. وهكذا ، اعتمادا على السؤال التجريبي ، يمكن تضمين الأنسولين أو حذفها.
وقد تم تحسين الإجراء المفصل أعلاه لعزل وثقافة الخلايا الشحمية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استزراع الماوس ، وربما الخلايا الشحمية للكائن الحي الآخر ، باسم MAAC. إذا كان للخلايا الشحمية الماوس أن تكون مثقفة كما MAAC هناك اعتبارات إضافية والاحتياطات التي ينبغي أن يوضع في الاعتبار. لقد وجدنا أن الخلايا الشحمية الناضجة من الفئران هي أكثر هشاشة بكثير من تلك التي من البشر. ونتيجة لذلك، ينبغي تقصير وقت الهضم إلى الحد الأدنى المطلق لزيادة صلاحية الخلية. وجدنا أيضًا أن الخلايا الشحمية من الفئران الصغيرة (8 أسابيع وأصغر) قدمت أقوى النتائج وأكثرها قابلية للتكرار. وأخيرا، يمكن أن يكون مثقف MAAC الماوس لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن بالنظر إلى أن النمط الظاهري adipogenic يبدو أقل استقرارا من البشر (والتي يمكن أن تكون مثقفة من خلال ما لا يقل عن أسبوعين) نوصي زراعة الماوس MAAC للحد الأدنى من الوقت المطلوب لمعالجة أسئلة تجريبية.
وبما أن نموذج MAAC يعتمد على استخدام أغشية نفاذة ، فإن إحدى مزايا هذه التقنية هي إمكانية المشاركة في زراعة الخلايا الشحمية الناضجة مع أنواع الخلايا الأخرى. لقد سبق لنا أن أظهرت قدرة الخلايا الشحمية ناضجة والضامة على التحدث عبر من خلال استخدام MAAC10. وهذا يفتح فرصا لمزيد من استكشاف الصلة بين السمنة، ومقاومة الأنسولين، والاستجابات المناعية15،16،17. يمكن أن تتضمن التجارب المستقبلية أنواع خلايا أخرى مثل خلايا الكبد أو الخلايا التوليفية أو الخلايا الفيوسلية أو خلايا البنكرياس لزيادة تعقيد نموذج MAAC وأهميته الانتقالية والتحقيق في الكلام المتبادل بين أنواع الخلايا المتعددة.
على الرغم من أن MAAC قد ثبت أن متفوقة في الحفاظ على وظائف وهوية الخلايا الشحمية نسبة إلى نماذج الخلايا الشحمية الأخرى في المختبر، كما أن لديها القيود التي تحتاج إلى النظر فيها. بالمقارنة مع استخدام الخلايا الشحمية المتمايزة عن الخلايا السليفة ، MAAC هو نموذج أكثر صعوبة وتستغرق وقتا طويلا. لوحات مع الأغشية هي أيضا أكثر تكلفة بالمقارنة مع لوحات ثقافة الخلايا العادية. الأهم من ذلك، الخلايا الشحمية ناضجة تحتاج إلى أن تكون معزولة حديثا في كل مرة عند البذر ولا يمكن توسيعها أو تجميدها في المخزونات مثل الخلايا السلائف. وبالتالي، فإن هذا يتطلب الحصول على عينات الأنسجة الدهنية البيضاء الطازجة، ولكنه يضيف أيضا مستوى من التعقيد الناجم عن الاختلافات بين المانحين والجهات المانحة.
هنا قدمنا بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الشحمية الناضجة البشرية وإنشاء MAAC. لقد أثبتنا أن الخلايا الشحمية الثقافية كما MAAC لا تزال قابلة للحياة من خلال أسبوعين، يتم الحفاظ على توقيعالجينات adipogenic، وأنها تستجيب للآلام الدوائية المتنوعة. استخدام MAAC يسمح لدراسة عبر الحديث بيتوين adipocytes وأنواع الخلايا الأخرى، وتقييم التغيرات فينوتيبيك على المدى الطويل من الخلايا الشحمية ناضجة استجابة لمحفزات مختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر شياو رونغ بينغ وستيفان هالن لتوفير الموارد وتحسين العزلة الدهنية، ومارتن أوربوم للمساعدة التقنية، ودانيال أولاوسون ومالين لون لتنسيق وتوفير الدهنية البشرية.
Materials
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18G, 1.20×40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150×21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6,5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Lotta, L. A., et al. Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance. Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).
- Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. Insulin resistance and impaired adipogenesis. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).
- Gesta, S., et al. Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression. Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).
- Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).
- Asada, S., et al. Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).
- Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).
- Harms, M. J., et al. Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding adipocyte differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).
- Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease. The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).
- Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. An Integrated View of Immunometabolism. Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).
