Захват сердечной травмы ответ целевых популяций клеток через очищенное сердце трехмерных изображений

Сердце уже давно считается пост-митотическим органом, но последние данные свидетельствуют о том, что обновление кардиомиоцитов происходит во взрослом сердце человека примерно на 1% в год¹. Тем не менее, эти низкие показатели кардиомиоцитов текучести являются недостаточными для пополнения массовой потери ткани, что происходит после травмы. Сердце, которое перенес инфаркт миокарда потеряет около одного миллиарда кардиомиоцитов, часто выступающей в качестве прелюдии к сердечной недостаточности и внезапной сердечной смерти^2,3. С более чем 26 миллионов людей, пострадавших от сердечной недостаточности во всем мире, есть неудовлетворенная потребность в терапии, которые могут обратить вспять ущерб, причиненный сердечно-сосудистых заболеваний⁴.

Для того, чтобы преодолеть этот разрыв в терапии, ученые начали исследовать эволюционно сохраненные механизмы, которые лежат в основе эндогенной регенерации после травмы. Одной из моделей для изучения регенерации сердца млекопитающих является неонатальная мышь. В течение недели после рождения, неонатальный мышей имеют надежный регенеративный ответ после повреждения сердца⁵. Мы ранее показали, что неонатальные мыши могут регенерировать свое сердце через пролиферацию кардиомиоцитов после апического резекции⁵. Хотя этот метод может вызвать регенерацию сердца у новорожденных, операция не имеет клинического отношения к травмам сердца человека. Для того, чтобы имитировать травмы человека в модели неонатальной мыши, мы разработали метод, чтобы вызвать инфаркт миокарда через окклюзию коронарной артерии⁶. Этот метод требует хирургической перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD), которая отвечает за доставку 40%-50% крови в левый желудочный миокард^6,7. Таким образом, операция приводит к инфаркту, который воздействует на значительную часть левой стенки желудочка. Это повреждение миокарда будет стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца у новорожденных^5.

Операция окклюзии коронарной артерии обеспечивает высоко воспроизводимый и непосредственно переводческий метод, чтобы раскрыть внутреннюю работу сердечной регенерации. Неонатальная хирургия параллели коронарного атеросклероза артерии в сердце человека, где накопление бляшек во внутренних стенках артерий может вызвать окклюзию и последующий инфаркт миокарда⁸. Из-за пустоты в терапевтических лечения для пациентов с сердечной недостаточностью, окклюзия в LAD связано с смертностью достигает до 26% в течение года после травмы⁹, и, следовательно, был назван “вдова Maker”. Достижения в области терапии требуют модели, которая точно отражает сложные физиологические и патологические последствия сердечной травмы. Наш хирургический протокол для неонатальной мыши сердечной травмы обеспечивает платформу, которая позволяет исследователям исследовать молекулярные и клеточные сигналы, которые сигнализируют регенерации сердца млекопитающих после травмы.

Недавние исследования подчеркивают динамическую взаимосвязь между внеклеточной средой и пролиферирующими кардиомиоцитами. Например, послеродовое регенеративное окно может быть расширено за счет уменьшения жесткости внеклеточной матрицы, окружающей сердце^10. Биоматериалы из неонатальной внеклеточной матрицы могут также способствовать регенерации сердца у взрослых млекопитающих сердца после сердечной травмы¹¹. Также сопровождающим пролиферацией кардиомиоцитов является ангиогенный ответ^12,,13; было показано, что образование побочных артерий, уникальное для регенерирующего сердца неонатальной мыши, имеет важное значение для стимуляции регенерации сердца^12. Кроме того, наша лаборатория показала, что сигнализация нерва регулирует пролиферацию кардиомиоцитов и регенерацию сердца через модуляцию уровней фактора роста, а также воспалительный ответ после травмы^14. Эти выводы подчеркивают необходимость отслеживания не миоцитных клеточных популяций в ответ на сердечную травму. Для достижения этой цели мы воспользовались системой рекомбинации Cre-lox в трансгенных линиях мышей, чтобы включить составные или условные выражения флуоресцентных белков репортера для отслеживания родословной. Кроме того, мы можем использовать передовые методы для определения клонального расширения шаблона с линией мыши Радуга, которая опирается на стохасическое выражение Cre-зависимых, многоцветных флуоресцентных репортеров, чтобы определить клональное расширение целевых популяций клеток¹⁵. Использование линии отслеживания с неонатальной коронарной артерии окклюзии хирургии является мощным инструментом для вскрытия сложных клеточных механизмов сердечной регенерации.

Отслеживание линии флуоресцентно маркированных клеток с трехмерной (3D) визуализацией всего органа трудно достичь с помощью традиционной секционной и восстановительных методов , особенно когда популяции клеток хрупкие, такие как нервные волокна или кровеносные сосуды. В то время как прямое изображение цельногорного органа оптическим сечением может захватывать поверхностные популяции клеток, структуры, которые находятся глубоко внутри ткани, остаются недоступными. Чтобы обойти эти барьеры, методы очистки тканей были разработаны, чтобы уменьшить непрозрачность целых тканей органов. В последнее время, значительные успехи были сделаны для ясной Липид-обменянный Акриламид-гибридизированные Rigid Imaging совместимых Ткань hYdrogel (CLARITY) на основе методов, которые очистить фиксированной ткани через липидной экстракции¹⁶. Также предпринимаются шаги по гомогенизации рефракционного индекса и последующему уменьшению рассеяния света во время визуализации¹⁷. Одним из таких методов является активный CLARITY, который ускоряет разложение липидов с помощью электрофореза, чтобы проникнуть в моющее средство по всей ткани¹⁸. Хотя этот метод очистки тканей требует дорогостоящего оборудования и может привести к повреждению тканей, что делает подход несовместимым с хрупкими популяциями клеток, такими как сердечные нервы^19. Таким образом, мы используем пассивный подход CLARITY, который опирается на тепло, чтобы мягко облегчить проникновение моющего средства, тем самым помогая в сохранении сложных клеточных структур^20,21.

Пассивный CLARITY, как правило, считается менее эффективным, чем активные CLARITY¹⁸, как техника часто сопровождается двумя основными препятствиями: неспособность очистить всю глубину органа и большое количество времени, необходимого для очистки тканей взрослых. Наш пассивный подход CLARITY преодолевает оба этих барьера с помощью ускоренного процесса очистки, который способен полностью очистить ткани сердца новорожденных и взрослых. Наша пассивная техника очистки тканей CLARITY достигла эффективности, которая позволяет визуализировать различные популяции сердечных клеток, включая редкие популяции, распределенные по всему взрослому сердцу. Когда очищенное сердце изображено с конфокальной микроскопией, архитектура клеточного узора во время развития, болезни и регенерации может быть освещена.