16S rRNA 荧光原位杂交检测膀胱活检中的组织驻留细菌

研究协议得到UT达拉斯分校和UT西南医学中心机构生物安全和化学品安全委员会的批准并遵循了该指南。本议定书中人体受试者活检的使用得到了UT达拉斯分校和UT西南医学中心机构审查委员会的批准和遵循。所有参与活检收集和处理的个人都拥有当前的人体主体保护 （HSP） 和 HIPPA 培训。 1. 固定和石蜡嵌入的组织准备 注：活检是从接受膀胱镜检查的妇女身上进行的，她们患有三联体炎，以便对复发性尿路感染进行高级管理。rUTI 定义为 12 个月内的 3 个 UTI。根据 UTSW IRB 协议 STU 082010-016 获得知情的患者同意后，在手术室进行活检采集，而患者处于麻醉状态。所有样品在实验前都进行了编码和去识别。 通过灵活的膀胱镜从膀胱三聚氰胺中获取冷杯 （±1 mm3） 活检，并立即放入含有 1.5 mL 4% v/v 甲醛 （PFA） 的无菌 2 mL 冷冻液中，在 1x 无菌磷酸盐缓冲盐水中制备（PBS）。注：1x PBS 中的 4% PFA 可以提前制成，并储存在 -20°C 下，直到需要为止。 在室温下固定活检6小时，在4°C下固定16-24小时。注：固定持续时间应根据组织样本的大小计算，应避免过度固定。不建议使用谷醛作为固定剂，因为它引入了自荧光。 在消毒罩或生物安全柜中，通过移液去除固定剂，并更换为 1.5 mL 无菌 1x PBS。将样品保持在4°C过夜，或立即进行组织处理和石蜡嵌入19。 使用灭菌的微生物将组织块分割为5μm厚度，并将石蜡组织部分粘附到带电玻璃显微镜幻灯片上。对于 16S rRNA FISH 协议，每个活检至少需要两张幻灯片。注：活检组织应相对于切割平面进行横截面排列，以确保所有截面的尿层可视化。还应注意的是，应针对细菌群落检测优化截面厚度。在组织驻留细菌极为稀少的感染（例如，每1，000个哺乳动物细胞中，<1组织驻留细菌）的感染可能需要更薄的节或多个序列部分的采样。 2. 使用通用 16S rRNA 探针的原位荧光杂交 注：每个活检需要两张幻灯片。通用 16S rRNA 探头需要一张幻灯片，带杂乱的序列的控制探头需要一张幻灯片。这对在显微镜期间区分真实信号和背景信号非常重要，因为膀胱上皮在多个通道中是自动荧光的。除了扰动探针，在安装前用0.1%苏丹黑B阻塞可能会减少组织20中固有的背景自荧光。 试剂和烟气罩的制备 用 70% 乙醇清洁空烟机罩（或适当安装的生物安全柜）。 在10 mL无菌过滤水中制备由0.9M氯化钠（NaCl）、20 mM Tris-HCl（pH 7.2）、0.1%硫酸二钠（SDS）组成的杂交缓冲液。注：无菌过滤水可通过 0.22 μM 过滤器通过灭菌蒸馏水制备。杂交缓冲液可在室温下储存，但SDS可能从溶液中沉淀。如果SDS沉淀，在使用前将溶液加热到50°C的水浴中。 在经过清洗的灭菌瓶中，将95%和90%乙醇分别制备至少100 mL。 在10mM Tris-HCl（pH 8.0）和1mM乙烯二甲酸（EDTA）缓冲液（TE）中溶解荧光标记的冻干剂探针，最终浓度为100μM。准备在 TE 缓冲区中稀释 1 μM，用于此协议。将100μM浓缩库存和1μM库存重组探头储存在-20°C，防止光线照射。注：请勿在水中溶解荧光标记的探针。需要缓冲以防止NHS酯键的水解将荧光酸与核苷酸探针结合。 用70%乙醇清洁5个Coplin罐，允许干燥，标签如下：二甲苯I，二甲苯II，95%EtOH，90%EtOH，ddH2O，并填充100 mL的适当溶液。这将有助于避免在后面的步骤中出现混淆。 组织脱石化和补液 在机罩中，将每个活检的两张幻灯片放入垂直滑动机架中。 将垂直滑动机架放入二甲苯 I Coplin 罐（包含 100 mL 的二甲苯）10 分钟。 从二甲苯 I 上拆下滑轨架，并将底部在纸巾上抹去，以去除多余的二甲苯。放入二甲苯 II 科普林罐 10 分钟。注：切勿在经过认证的烟气罩外使用二甲苯。 连续乙醇洗洗中补水脱水组织部分（95%和90%）在分别标有科普林罐子中各10分钟。注：在此阶段，水浴中温式杂交缓冲液温度为50-56°C 从 90% 乙醇洗涤液中取出滑轨架，在纸巾上将底部抹去多余的乙醇，并放入含有 100 mL 过滤消毒 ddH2O 的 ddH2Coplin 罐中 10 分钟。 在等待 ddH2O 洗涤时，将分针稀释到 10 nM 的杂交缓冲液中，以创建染色溶液。每张幻灯片准备 150 μL 的染色溶液。注：通过将管子包裹在铝箔中并存放在抽屉中，保护染色溶液免受光线照射。在台面上使用荧光标记探头时，请考虑在可能时关闭顶灯。不应重复使用在杂交缓冲液中稀释的探针。 杂交和反染色 将浸泡、皱褶的 Kimwipe 和无菌水放入 P1000 尖端盒的储液罐中，为每个探头准备一个加湿室。将吸头盒放在顶部 – 这是幻灯片的坐位置。注：使用加湿室防止活检部分在杂交过程中干燥非常重要。应当指出，市售加湿室旨在维持稳定、潮湿的环境。然而，这里详述的技术以大大降低的成本充分控制湿度。 从滑架上取下滑轨，然后放在新的纸巾上（纸巾面上）。使用 Kimwipe 擦干幻灯片。小心，只需轻轻涂抹靠近（不上）活检部分，以吸走水。使用疏水笔，在活检部分周围绘制边框，并将滑动组织侧上放在加湿室中。注：工作迅速，使组织在杂交前不会变干。 将加湿室放入设置为 50°C 的培养箱中。移液器 50-150 μL 的染色溶液直接位于组织顶部，以便填充组织周围疏水边界制作的矩形。小心不要添加太多的溶液溢出疏水边界。轻轻合上盒子。 在黑暗中在50°C下孵育过夜（±16小时）。如果孵化器有一个窗口，用铝箔盖住它，以创造一个黑暗的环境。注：需要低于 FISH 探头熔融温度的杂交温度才能发出可靠的信号。50°C 是通用 16S rRNA 探针的最佳温度，但可能不是其他探头的最佳温度。 第二天早上，在 ddH2O 中制备至少 500 mL 的洗涤缓冲液，包括 0.9 M NaCl、20 mM Tris-HCl （pH 7.2）和过滤消毒器，并放入带真空瓶顶过滤器的无菌瓶中。水浴加热至50-56°C。 从加湿室中取出幻灯片，并用 Kimwipe 小心地清除任何剩余的杂交溶液。将幻灯片放在垂直染色架上。 将染色架放入一个不透明的科普林罐中，该罐含有 100 mL 的预加热洗涤缓冲液，为期 10 分钟。如果 Coplin 罐子不是不透明的（例如玻璃），则在孵育步骤时将其置于黑暗中 – 可能放在盒子下或抽屉里。 在新的科普林罐中用新鲜的洗涤缓冲液重复洗涤步骤两次。 在洗涤步骤中，通过稀释 Hoechst 33342 1：1，000 的 100 μg/mL 库存溶液，在洗涤缓冲液中准备反污渍。在同一管中，将Alexa-555小麦胚芽凝乳素（WGA）添加到5μg/mL的最终浓度中，将Alexa-555Phalloidin添加到33 nM的最终浓度中。在黑暗中储存，直到准备好使用。注：Hoechst、Alexa-555 WGA 和 Alexa-555 Phalloidin 分别标记 DNA、粘素/尿素和 Actin，根据制造商的说明可以长期储存在黑暗中。用于探头和反印的荧光标签可以针对可用于显微镜的过滤器集进行定制。 从上次洗涤中取出滑轨，并用 Kimwipe 轻轻吸走多余的洗涤缓冲液。将滑片组织侧上放在纸巾上，并在组织顶部直接添加 50-150 μL 的反污渍，以便填充疏水边界，但不会溢出。用冷冻盒顶覆盖多达四张幻灯片，并在室温下孵育10分钟。 将两侧放回染色架中，用新鲜的洗涤缓冲液在科普林罐中再洗两次，每次10分钟。 上次清洗后彻底擦干滑片，并将纸巾侧放在冷冻盒顶下的纸巾上。直接在组织顶部挤压一滴安装介质。轻轻地将适当尺寸的盖玻片（取决于活检尺寸）放在顶部。轻轻压出任何气泡，因为它们会干扰成像，让盖玻底的幻灯片在黑暗中过夜固化。 第二天，用一层淡淡的指甲油将盖玻片的边缘密封到幻灯片上。在黑暗中干燥10分钟，然后储存在黑暗中4°C，进行共聚焦显微镜。 3. 通过共聚焦显微镜对16S rRNA FISH的可视化 注：对于该协议，使用具有 63 倍和 100 倍目标的激光扫描共聚焦显微镜可实现最佳结果。需要适当的滤波器集来可视化 Hoechst、Alexa-488 和 Alexa-555 荧光。但是，如果共聚焦显微镜不可用，可以使用标准荧光显微镜。该协议适用于激光扫描共聚焦显微镜。 根据制造商的说明打开共聚焦显微镜和与显微镜相关的计算机软件。 加载幻灯片，并在蓝色 （DAPI/Hoechst） 通道中使用 10 倍目标进行可视化。仔细观察，直到原子核可见。 聚焦后，将目标更改为高放大倍率（63 倍或 100 倍）。在盖玻片上加油。重新聚焦新目标，确保对焦时物镜与机油接触。注：在高放大倍率（63 倍或 100 倍）下仅使用精细对焦。石油只能用于石油目标。 快速评估绿色 （eGFP/Alexa-488） 通道中的每个幻灯片，以确定哪些幻灯片为 FISH 正，哪些为 FISH 负片。注：最好由单独的个体进行初始评估/评分，以减少实验偏差。 要对染色的活检进行图像成像，请从 FISH 正滑片开始，然后切换到计算机可视化模式。选择 405（霍赫斯特）、488（Alexa-488）、555（Alexa-555）通道。使用最长的波长通道（本例中为 555）设置针孔。在 488 通道中查找用于标记细菌可视化的正确焦平面。在不更改焦平面的情况下，设置每个通道的增益、激光功率和偏移，使信号不饱和，并且背景不会过度校正。获取所有三个通道中的图像。注：对 488 通道使用相同的设置来成像实验中的每张幻灯片。如果细菌可视化的最佳焦平面在场间发生变化，则激光功率可能需要在 405 和 555 通道中进行调整。 在附加字段上重复上述步骤，直到获取整个上皮表面的图像。注：您可能需要稍微更改焦平面，以可视化不同字段中标记的细菌，但切勿更改场间 488 通道的增益、激光功率或偏移。如果在共聚焦显微镜上工作，捕获 Z 堆栈可能信息丰富，以便分析组织内细菌的三维定位。 使用 ImageJ 或类似软件处理图像并量化组织内或与组织相关的标记细菌。建议对图像进行最少的处理（例如，拆分/合并通道并转换为图像文件），但如有必要，可以执行背景校正。所有校正或其他改动应在图像之间保持一致。