Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Steven E. Guard; Christopher C. Ebmeier; William M. Old

doi:10.3791/60432

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Published: November 17, 2019

doi:

10.3791/60432

Steven E. Guard¹, Christopher C. Ebmeier¹, William M. Old^1,2

¹Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology,University of Colorado, ²Linda Crnic Institute for Down Syndrome,University of Colorado School of Medicine

Summary

Descritto è un flusso di lavoro proteomico per identificare i partner di interazione delle proteine da una frazione subcellulare nucleare utilizzando l’arricchimento dell’immunoaffinità di una determinata proteina di interesse e la spettrometria di massa priva di etichette. Il flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione dei campioni assistiti dal filtro, pulizia offline, spettrometria di massa e una pipeline bioinformatica a valle.

Abstract

La spettrometria di massa della purificazione dell’immunoaffinità (IP-MS) è emersa come un robusto metodo quantitativo per identificare le interazioni proteina-proteina. Questa pubblicazione presenta un flusso di lavoro proteomico di interazione completo progettato per identificare le interazioni proteina-proteina a bassa abbondanza dal nucleo che potrebbero essere applicate anche ad altri compartimenti subcellulari. Questo flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione del campione, pulizia offline, spettrometria di massa senza etichetta e analisi computazionale e visualizzazione dei dati a valle. Il nostro protocollo è ottimizzato per rilevare interazioni compartimentate e a bassa abbondanza che sono difficili da identificare da lismi cellulari interi (ad esempio, interazioni con fattori di trascrizione nel nucleo) mediante l’immunoprecipitazioni di proteine endogene da compartimenti subcellulari frazionati. La pipeline di preparazione del campione qui descritta fornisce istruzioni dettagliate per la preparazione dell’estratto nucleare delle cellule HeLa, la purificazione dell’immunoaffinità della proteina endogena delle esche e l’analisi della spettrometria di massa quantitativa. Discutiamo anche considerazioni metodologiche per l’esecuzione di immunoprecipitazioni su larga scala in esperimenti di profilazione dell’interazione basati su spettrometria di massa e forniamo linee guida per valutare la qualità dei dati per distinguere la vera proteina positiva interazioni da interazioni non specifiche. Questo approccio è dimostrato qui studiando l’interagentima nucleare della chinasi CMGC, DYRK1A, una chinasi proteica a bassa abbondanza con interazioni mal definite all’interno del nucleo.

Introduction

Il proteoma umano presenta una vasta diversità strutturale e biochimica attraverso la formazione di complessi multisubunità stabili e interazioni transienti proteina-proteina. Di conseguenza, l’identificazione dei partner di interazione per una proteina di interesse è comunemente necessaria nelle indagini per svelare il meccanismo molecolare. I recenti progressi nei protocolli di purificazione dell’affinità e l’avvento della strumentazione di spettrometria di massa ad alta risoluzione a scansione rapida hanno permesso una facile mappatura dei paesaggi di interazione delle proteine in un unico esperimento imparziale.

I protocolli di interazione delle proteine utilizzano comunemente sistemi di espressione ectopica con costrutti di fusione con etichettatura di affinità per identificare le interazioni proteiche senza richiedere anticorpi di alta qualità che riconoscano una proteina di interesse¹^,². Tuttavia, i metodi basati su tag dell’epitopo presentano diversi svantaggi. Le interazioni fisiche con l’epitopo possono portare alla rilevazione di proteine copurificanti non specifiche³. Inoltre, la fusione di questi tag dell’epitopo con il terminale N o C di una proteina può bloccare le interazioni autoctone proteina-proteina, o interrompere il ripiegamento delle proteine per promuovere conformazioni non fisiologiche⁴. Inoltre, i sistemi di espressione ectopica in genere sovraesprimono la proteina esca a concentrazioni soprafisiologiche, il che può portare all’identificazione delle interazioni artifeffettiche delle proteine, in particolare per i geni sensibili al dosaggio⁵. Per aggirare questi problemi, la proteina endogena può essere immunoprecipitata insieme alle proteine delle prede interagenti associate, assumendo la disponibilità di un anticorpo di alta qualità che riconosce la proteina nativa.

Fornito qui è un flusso di lavoro proteomico di interazione per rilevare l’interagentima nucleare di una proteina endogena utilizzando la proteina CMGC chinasi DYRK1A come esempio. L’interruzione del numero di copia DYRK1A, livello di attività, o espressione può causare grave disabilità intellettuale negli esseri umani, e letalità embrionale nei topi⁶^,⁷^,⁸^,⁹. DYRK1A presenta un regolamento spatiotemporale dinamico¹⁰e interazioni trapartimentate delle proteine¹¹^,¹², che richiedono approcci in grado di rilevare partner di interazione a bassa abbondanza specifici di diversi compartimenti subcellulari.

Questo protocollo impiega la frazione cellulare delle cellule HeLa umane in frazioni di citosol e nucleoplasma, l’immunoprecipitazioni, la preparazione del campione per la spettrometria di massa e una panoramica di una pipeline bioinformatica per valutare la qualità dei dati e i risultati visivi, con script R forniti per l’analisi e la visualizzazione (Figura 1). I pacchetti software proteomici utilizzati in questo flusso di lavoro sono tutti liberamente disponibili per il download o sono accessibili tramite un’interfaccia web. Per ulteriori informazioni sul software e sui metodi di calcolo, tutorial approfonditi e istruzioni sono disponibili ai link forniti.

Protocol

NOTA: tutte le composizioni tampone e le miscele di proteasi sono descritte nella Tabella 1. 1. Preparazione delle cellule NOTA: Per questo approccio alla spettrometria di massa di immunoprecipitazioni (IP-MS) è desiderato un materiale di partenza di 1-10 mg di lisa nucleare per replica. Le quantità di cellule saranno somministrate per 1 mg di immunoprecipitazioni nucleari in triplice copia dei controlli del triplice. Se si utilizza una linea cellulare aderente, far crescere le cellule al 90% di confluenza in 3 x 15 cm piatti per replica prima della raccolta.NOTA: Si raccomanda di eseguire un minimo di tre immunoprecipitazioni replicate per le esche e le condizioni di controllo. Questo protocollo assumerà l’uso di controlli “solo perline”, che controllano abbondanti interazioni non specifiche con le perline, a partire dalla sezione 4. Altri tipi di controlli possono essere utili. Questi sono descritti in modo approfondito nella sezione di discussione. Lavare piastre 2 volte con fosfato gassare salina (PBS) e provare le cellule utilizzando 3 mL di 0,25% di metapsina per piastra 15 cm. Girare verso il basso le cellule a 1.200 x g per 5 min e decantare la trypsin. Per le cellule sospensione, crescere a una scala simile / densità per raggiungere 70-80 mg di proteine totali. Cellule di pellet a 1.200 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.NOTA: I pellet possono essere combinati durante questa fase per consentire un’elaborazione efficiente utilizzando la frazione subcellulare su larga scala descritta nella sezione 2. Lavare il pellet cellulare 2x con PBS – 5 mM MgCl2 integrato con inibitori della proteasi (PI) e inibitori del fosfofosi (FIS) (vedi tabella 1).NOTA: I pellet cellulari possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per la frazione. 2. Preparazione dell’estratto nucleare NOTA: Gli inibitori della proste e del fosforo devono essere aggiunti ai buffer di frazionamento entro 30 minuti di utilizzo. Se congelati, scongelano i pellet cellulari per 15 min in 1x volume di pellet di freddo Buffer A – PIs / PhIs. Mettere il pellet cellulare su un nodatore a 4 gradi centigradi per facilitare la sospensione durante lo scongelamento. In caso contrario, risospendere il pellet della cella dal passaggio 1.3 nel buffer del volume di pellet 1x A e PIs /PhIs. Pellet a 2.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Decant il buffer. Sospendere le cellule con 5 volte il volume delle celle imballate con buffer A e incubare sul ghiaccio per 20 min. Pellet a 2.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Decant il buffer e resuspend con 2x volume di cella originale compresso Buffer A – PIs / PhIs e sbalzare 7x con “A” / pestello sciolto. Centrifugare il lisato per 10 min a 2.000 x g e 4 gradi centigradi. Con attenzione pipetta fuori il supernatante e flash congelare con azoto liquido. Conservare il lisato a -80 gradi centigradi. Il supernatante di questo passo è la frazione subcellulare citosolica.NOTA: Il pellet nucleare può essere salvato durante questa fase con gelando in flash con azoto liquido e conservandolo a -80 Risospendere il pellet con volume di pellet di 0,9x di Buffer B / PIs / PhIs e mescolare su un nodoper per 5 min a 4 gradi centigradi. Per lisizzare i nuclei, far rimbalzare 20x con un pestello più stretto “B”. Mescolare il lisato nucleare su un nutatore per 30 min a 4 gradi centigradi in modo che sia omogeneo. Centrifugare il lisa nucleare per 30 min a 21.000 x g a 4 gradi centigradi. Pipetta fuori il supernatante e salvare come un estratto di proteina nucleare solubile.NOTA: il trattamento con nuclease del pellet nucleare risultante consente il recupero di una frazione proteica associata alla cromatina. Diallyze l’estratto nucleare solubile contro buffer C : PI per 3 h a 4 gradi centigradi. Tagliare una lunghezza appropriata di 24 mm di larghezza tubo di dialisi con un 8 kDa peso molecolare tagliato. Bloccare un lato del tubo e caricare nucleopoltismo nel tubo. Dopo aver caricato il lysate, bloccare l’altra estremità e immergersi in un contenitore di vetro pulito contenente buffer C e PI. Centrifugare l’estratto/nucleoplasmo nucleare dialyzed a 21.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min. L’estratto nucleare utilizzato per l’analisi IP-MS può essere congelato e flash congelato in azoto liquido e conservato a -80 gradi centigradi, se necessario. 3. Convalida della frazione subcellulare Completare un saggio proteico per determinare la concentrazione proteica del lisato nucleare. Un saggio di proteina di acido bicinchoninico fornisce una sensibilità sufficiente per l’applicazione a valle. Caricare 20 g di frazioni citosoliche e nucleari su un gel SDS-PAGE per l’analisi delle macchie occidentali, come descritto in precedenza13. Salta le corsie durante il caricamento per evitare errori di caratterizzazione di un campione. Sondare la macchia occidentale per p84 (THOC1) come marcatore nucleare, e GAPDH come marcatore citosolico. Determinare l’estensione della frazionazione in base al rapporto del marcatore citosolico nella frazione nucleare e viceversa.NOTA: possono essere utilizzati anticorpi per altri marcatori nucleari e citosolici. 4. Immunoprecipitazioni di proteine endogene esche nucleari NOTA: Da questo momento in esordio si consiglia di utilizzare tubi a bassa ritenzione. Ciò ridurrà il legame non specifico ai tubi durante la manipolazione del campione ed eviterà inutili perdite di campione. Inoltre, assicurarsi che LCMS grado H2O viene utilizzato per preparare i buffer per i passaggi rimanenti. Preparare una miscela di proteine A/G per ogni replica combinando 12,5 litri di volume di perline sia per proteine-A che per proteine-G in tubi di microcentrismo. Conservare gli stock di perline come un liquame contenente il 20% di etanolo. Determinare la concentrazione di perline all’interno del liquame %(v/v) e pipette il volume necessario utilizzando una punta pipetta che è stata tagliata sulla punta per garantire che le perline possano entrare nella punta. Lavare la proteina A/G miscela di perline 2x con 300 s l di IP Buffer 1. Girare le perline a 1.500 x g a 4 gradi centigradi per 1 min e tampone decant. Preparare le perle A/G anticorpi: Per legare l’anticorpo alle perline, aggiungere 300 l di IP Buffer 1 e 10 g dell’anticorpo desiderato. Lasciare la miscela di perline/anticorpi a roccia su un nutator a 4 gradi durante la notte. Per i controlli solo pertinni, non aggiungere alcun anticorpo.NOTA: Un totale di 10 g di anticorpi per replica può essere utilizzato come punto di partenza, ma l’importo esatto dovrà essere ottimizzato per ogni singolo anticorpo e la scala del lisato utilizzato nell’esperimento Scongelare i lisati nucleari dal punto 2.10 in un bagno d’acqua e volumi appropriati di aliquota in tubi di microcentrifuga a bassa ritenzione per 1 ingresso di proteine mg per replica. Girare il lisato a 16.000 x g per 30 min e trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungete 1 l di benzonase (250 unità/L) per 1 mg del lisato nucleare e la roccia su un bacattatore a 4 gradi centigradi per 10-15 min. Preparare perline per preclearing il lisato. Aggiungete 12,5 l of ogni proteina A e perline proteiche G a tubi di bassa ritenzione da 1,5 ml come al punto 4.1. Lavare 2x con IP Wash Buffer 1 – PIs e decantare il buffer. Aggiungere 1 mg del lisato nucleare alle perline dal punto 4.5. Incubare mentre dondola su un nutator per 1 h a 4 gradi centigradi. Centrifuga listi prevessati a 1.500 x g e 4 gradi centigradi per 1 min. Mentre i listi nucleari sono incubatori con perline al passo 4.5.1, lavare le perle A/G anticorpi 2x con IP Buffer 1 – PI. Centrifuga a 1.500 x g e 4 gradi centigradi per 1 min e decantare il buffer. Trasferire il lisato nucleare precleared dal passo 4.6.1 sulle perle A/G anticorpo-proteina. Incubare a 4 gradi centigradi per 4 h. Centrifuga dopo l’incubazione a 1.500 x g e 4 gradi centigradi per 1 min. Trasferire il supernatante in tubi etichettati come il flusso attraverso per ogni replica. Lavare le perline A/G anticorpi con 1 mL di IP Buffer 2 e PI. Centrifuga a 1.500 x g e 4 gradi centigradi per 1 min, tampone di decant, e ripetere per un totale di 3x. Lavare le perline 2x con 1 mL di IP Buffer 1 p centrifugare come nel passaggio precedente. Assicurarsi che tutto il buffer venga rimosso dopo l’ultimo lavaggio. Elute 2x con 20 m glicina (pH 2,75) per 30 min ciascuno. Assicurarsi che i tubi siano a dondolo durante l’incubazione con il tampone di eluizione. Girare a 750 x g e 4 gradi centigradi per 1 min e pipetta fuori dal supernatante dopo ogni incubazione di 30 minuti.NOTA: Mentre il metodo della glicina a basso pH descritto qui eluisce la maggior parte delle proteine delle esche, alcune interazioni anticorpo-antigene richiedono condizioni di tampone più rigorose. Il blocco flash elua in azoto liquido e conserva a -80 gradi centigradi. 5. Preparazione del campione NOTA: L’insulina che ha colpito i campioni di eluzione dell’immunoprecipitazioni aiuta nel recupero delle proteine durante la precipitazione e la lavorazione dell’acido tricloroacetico (TCA), che è importante per le proteine endogene dell’esca endogene a bassa abbondanza. Scongelare gli eluati a temperatura ambiente se congelati. Mettere i campioni sul ghiaccio e aggiungere 10 – L di 1,0 mg/mL di insulina per ogni 100 – L di eluate. Vortice e poi aggiungere immediatamente 10 – L di 1% deossicolato di sodio. Vorticare di nuovo il campione e aggiungere 30 – L di 20% TCA seguito da un vortice finale. Incubare i campioni sul ghiaccio per 20 min, quindi centrifugare a 21.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min. Aspirare il superataee e aggiungere 0,5 mL di acetone che è stato prefreddo a -20 gradi centigradi. Vortice e poi girare a 21.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min. Ripetere questo passaggio. Aspirare il supernatante e l’aria asciugare il pellet rimanente nella parte inferiore del tubo. Preparare l’esempio per la spettrometria di massa utilizzando un metodo FASP (Filter Aided Sample Prep) modificato, ottimizzato per ridurre la gestione dei campioni, come descritto di seguito in14. Risospendere il pellet proteico dal punto 5.1.4 con 30 L di SDS Alkylation Buffer (vedere la tabella 1). Incubare il campione su un blocco termico di 95 gradi per 5 minuti. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 15 min prima di far precedere la fase successiva. Aggiungete 300 l di soluzione UA e 30-L di 100 mM di TCEP ad ogni campione. Caricare questa soluzione su un filtro centrifugo 30k. Girare il filtro centrifugo a 21.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.NOTA: La proteina esca e i suoi interreattori putativi devono essere legati al filtro a questo punto. Tuttavia, il flusso attraverso può essere mantenuto, nel caso in cui si verifichi un problema con il filtro. Lavare il filtro con 250 s l di UA e centrifugare a 21.000 x g per 10 min. Decant il flusso attraverso e ripetere per un totale di 3x. Lavare il filtro con 100 mL di 100 mM Tris pH 8,5 e centrifugare a 21.000 x g per 10 min. Aggiungere 3 -l l di 1 g/l lys C risospeso in 0,1 M Tris pH 8,5. Riempire i filtri fino al segno di 100 gradi e lasciare digerire per 1 h a 37 gradi centigradi mentre si dondola su un nocciolato. Aggiungete 1 ol di 1 g/l MS di grado trypsin. Mescolare delicatamente e lasciare che la trypsin incubare con il campione pernottato a 37 gradi centigradi mentre dondola su un adolatore. Centrifuga a 21.000 x g per 20 min per eluire il peptide dal filtro.NOTA: potrebbero essere necessari più cicli di centrifugazione per recuperare tutto l’eluate. In caso contrario, è possibile che si verifichi una grave perdita di campioni. Disalare i peptidi utilizzando colonne di spin C18. Seguire il protocollo fornito dal produttore. Risospendere il peptide linfofilo in 7 -L di 0,1% TFA nel 5% acetonitrile. Sonicare il campione per 3 min per garantire che i peptidi siano stati risospesi. Girare verso il basso a 14.000 x g per 10 min. Trasferire il peptide risospeso in una fiala campione appropriata per il caricamento sul sistema di cromatometria-spettrometria di massa liquida (LC/MS). 6. Idoneità del sistema LC/MS NOTA: a causa della piccola scala e generalmente inferiore abbondanza di proteine da campioni purificati di affinità, è fondamentale che la piattaforma LC/MS operi a una sensibilità e robustezza massime. Aggiungere 1 mL di acido formico LC/MS a 1 L di acqua di grado LC/MS per la fase mobile A e aggiungere 1 mL di acido formico LC/MS a 1 Ldi di acetonitrile di grado LC/MS per la fase mobile B. Preparare o installare una colonna capillare fusa da 75 m con una resina C18 in fase invertita di 250 mm di lunghezza. I migliori risultati saranno ottenuti con un’iniezione diretta di campioni nella colonna. Elimina il sistema Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) con nuove fasi mobili. Con una colonna C18 installata, stabilire una portata stabile e l’elettrospray con un emettitore adatto (cioè 20 m id x 360 m od tirato su una punta di 10 m). Mantenere la colonna a 40-60 gradi centigradi. Testare le prestazioni complessive del sistema LC/MS iniettando un complesso standard di controllo qualità, ad esempio 100-200ng di un digest triptico lysato e a tutta cellula HeLa. Elute con un gradiente adatto per un campione complesso (ad es. Stabilire una base delle prestazioni di base del peptide e delle identificazioni proteiche.NOTA: per ottenere i migliori risultati, 3.000 o più identificazioni proteiche da 20.000-35.000 peptidi unici forniranno prestazioni ottimali per i campioni sperimentali. Per l’idoneità di routine del sistema LC/MS, iniettare 100-200 fmol o meno di un singolo standard di digestione proteica, come Bovine Serum Albumin (BSA). Elute con una breve pendenza (cioè, 20-30 min).NOTA: Iniezioni multiple di un digest proteico aiuteranno a stabilire le prestazioni del sistema LC/MS di base, e l’iniezione ripetuta dopo ogni campione IP-MS fornisce una misura delle prestazioni del sistema durante l’esperimento e consente il rilevamento della deriva dello strumento, che può bias gli esperimenti senza etichetta. Una linea di base delle singole intensità di picco selezionate e delle forme di picco verrà informata delle prestazioni di MS, LC e colonna. Per evitare di sovraccaricare la colonna analitica, caricare una piccola porzione (15-30% del totale) di un campione sperimentale sulla colonna e separarlo utilizzando un gradiente adatto per campioni complessi (ad es. Se il numero di identificazioni proteiche non è soddisfacente, caricare tutto il campione sulla colonna. Eseguire uno standard di digest di singola proteina tra i campioni per monitorare le prestazioni del sistema LC/MS e il riporto del campione. Potrebbero essere necessari più standard per ridurre il riporto del campione a seconda dei campioni. 7. Trattamento dei dati Scarica il pacchetto software proteomico MaxQuant che si trova allhttps://www.maxquant.org/.NOTA: Questo verrà utilizzato per elaborare il file di dati RAW MS dal passaggio 6.6 in tabelle di dati di ID proteici, nomi genici e valori quantitativi associati all’identificazione di questi per l’analisi a valle. Selezionare Carica all’interno del sottotitolo Dati di input della scheda Dati non elaborati. Fare clic sulla scheda Specifico del gruppo e selezionare Digestione. All’interno dell’elenco degli enzimi selezionare LysC e fare clic sulla freccia destra per aggiungere questo enzima nell’elenco che verrà utilizzato nella ricerca. Quindi, selezionare Strumento e assicurarsi che nell’elenco a discesa nella parte superiore dello schermo venga visualizzato il tipo di strumento corretto. Lasciare altri parametri di ricerca specifici del gruppo nelle impostazioni standard. Fare clic sulla scheda Parametri globali e selezionare Sequenze. Aggiungere il file FASTA appropriato per la tassonomia che verrà utilizzata nella ricerca. I peptidi non verranno assegnati correttamente se ciò non viene eseguito. Per il proteoma umano, scaricare il file FASTA da UniProt allhttps://www.uniprot.org/help/human_proteome. All’interno della scheda Parametri globali, fare clic su Quantificazione proteica. All’interno del menu a discesa Peptidi per la quantificazione, selezionare Univoco – Rasoio.NOTA: MaxQuant offre la quantificazione alternativa delle proteine attraverso la quantificazione assoluta basata sull’intensità (iBAQ) e la quantificazione senza etichette (LFQ). Tuttavia, le informazioni sul conteggio dei peptidi sono sufficienti per l’analisi a valle in questo protocollo15. Nella parte inferiore sinistra dell’interfaccia MaxQuant, selezionare il numero di processori da utilizzare per la ricerca. Ciò influirà direttamente sul tempo necessario per la corsa, quindi selezionare il maggior numero possibile per questo). Fare clic su Start nella parte inferiore sinistra dello schermo per avviare la corsa. Selezionare la scheda Prestazioni nella parte superiore dello schermo per visualizzare l’avanzamento della ricerca. Al termine dell’esecuzione, aprire il file proteingroups.txt in Perseus, una piattaforma di calcolo proteomica o un altro foglio di calcolo per visualizzare i dati16. Utilizzare Perseo per rimuovere contaminanti e colpi comuni per invertire le sequenze proteiche. Seguire la documentazione dettagliata di Perseus allhttp://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.NOTA: l’apertura del file proteingroups.txt nel software di analisi (ad esempio Excel) corromperà automaticamente alcuni nomi di geni e proteine. Analizzare i dati sperimentali utilizzando il Contaminant Repository for Affinity Purification (CRAPome). Registrare un account in questo repository http://crapome.org/ e seguire il tutorial in base alle esigenze17,18. Utilizzare il flusso di lavoro Analizza i dati disponibile nella home page di CRAPome. Selezionare i controlli esterni che corrispondono al sistema di purificazione dell’affinità usato in questo esperimento di interazione.NOTA: Questi controlli possono essere utilizzati per calcolare un arricchimento di cambio di piega secondo utile per rilevare contaminanti comuni. Generare un file di input dall’output proteingroups.txt di MaxQuant utilizzando Perseus o un’applicazione per fogli di calcolo adatta. I dettagli per la formattazione manuale sono disponibili in http://crapome.org/?q=fileformatting. In alternativa, utilizzare lo script R fornito “export_CRAPomeSAINT_Input_File.R” per generare il file di input SAINT/CRAPome. Vedere README.txt nella finestra file di codifica supplementare. Eseguire un’analisi per determinare l’arricchimento del cambiamento di piegatura e la probabilità di SAINT (Significance Analysis of INTeractome) per ogni proteina esca nell’immunoprecipitazioni. Assicurarsi che ‘Controlli utente’sia selezionato nel menu a discesa sotto FC-A, ‘Controlli CRAPome’ o ‘Tutti i controlli’ nell’elenco a discesa FC-B e Punteggio di probabilità sia selezionato per generare probabilità SAINT. Al termine dell’esecuzione, visualizzare l’output disponibile in “Risultati analisi” insieme a un ID processo. Scaricare la matrice di dati da “Risultati analisi” per il grafico e la visualizzazione dei dati futuri. Tracciare le proteine in funzione della probabilità FC-A (IP rispetto ai controlli utente) e di SAINT seguendo gli Script R forniti in File di codifica supplementari.NOTA: viene fornito un set di script R per la produzione di grafici di probabilità FC-A contro SAINT e iBAQ rispetto al log2 (abbondanza di proteine), colorati dalla gamma di valori p regolati dall’analisi empirica di Bayes delle intensità prive di etichetta. I dettagli dell’analisi statistica differenziale e della stampa sono disponibili in README.txt e nello script R “main_differential_analysis. R” nella finestra di dialogo File di codifica supplementari. Valutare dove le proteine interagenti note della proteina esca sono classificate per FC-A e SAINT. Fai un taglio di FC-A > 3.00 e SAINT > 0.7 per esperimenti a singola esca in triplice copia come punto di partenza.NOTA: la selezione dei tagli per un interactiano ad alta confidenza e un interagito “a bassa fiducia” deve essere informata da informazioni biologiche. 8. Visualizzazione dei dati NOTA: Ci sono molti programmi che possono visualizzare efficacemente i dati proteomici (ad esempio, R, Perseo, Cytoscape, STRING-DB). L’analisi della connettività tra colpi ad alta fiducia e arricchimento funzionale di questi interattori può essere una strategia utile per dare priorità agli hit per un’ulteriore convalida e caratterizzazione funzionale. Scarica Cytoscape, uno strumento di visualizzazione della rete open source allhttps://cytoscape.org/download.html19. Preparare un file di input per i dati di interazione come un file delimitato da tabulazioni formattato con tre colonne: bait (nodo di origine), preda (nodo di destinazione), tipo di interazione (tipo di bordo). Questo può essere fatto in Perseus o qualsiasi programma di foglio di calcolo di vostra scelta. Selezionare l’icona Importa tabella da file verso la parte superiore sinistra del programma (indicata da una freccia verso il basso e da una matrice nell’icona). Cytoscape popolerà automaticamente i dati di interazione in una rete pronta per la formattazione e la progettazione personalizzate. Selezionare la scheda Stile nel pannello di controllo per Cytoscape e fare clic sui quadrati nella colonna Def per regolare l’attributo per l’intera rete. Selezionare nodi o bordi specifici nella rete, quindi selezionare il quadrato all’interno della colonna Byp. del menu degli stili per ignorare le impostazioni predefinite e regolare solo gli oggetti selezionati. In alternativa, fare clic sul menu a discesa nella parte superiore del menu degli stili per visualizzare i formati di rete preimpostati.NOTA: I dati di interazione proteina-proteina STRING-db possono essere integrati in questa rete in questo momento manualmente attraverso il file di input o attraverso vari strumenti di arricchimento disponibili come plug-in in Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. Un plug-in citoscape consigliato per l’analisi dell’arricchimento si trova allhttp://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. Per aumentare la fiducia nel set di dati generato in questo flusso di lavoro, eseguire esperimenti reciproci IP-MS o IP-western che prendono di mira le proteine prede di interesse come esca.

Representative Results

La maggior parte della massa proteica identificata in un esperimento IP-MS è costituita da proteine non specifiche. Pertanto, una delle sfide principali di un esperimento IP-MS è l’interpretazione di quali proteine sono interactiani ad alta fiducia rispetto agli interactiani non specifici. Per dimostrare i parametri cruciali utilizzati nella valutazione della qualità dei dati, lo studio ha analizzato le immunoprecipitazioni triplice da 5 mg di estratto nucleare HeLa utilizzando un controllo solo del tallone. Il primo controllo interno per garantire che un esperimento IP-MS sia affidabile è se la proteina esca si collochi come una delle proteine più arricchite identificate sia dal cambiamento di piegatura rispetto al controllo che dalla probabilità di SAINT. In questo caso, l’esca DYRK1A classificato tra i primi tre proteine arricchite sopra il controllo (Figura 2A,B). In uno studio sull’interactoma nucleare su DYRK1A che utilizza quattro anticorpi indipendenti, un taglio FC-A di >3.00 e un taglio di probabilità SAINT >0,7 hanno fornito un taglio rigoroso per l’identificazione sia degli intereuropei nuovi che di essi convalidati in precedenza22 . Se applicata a questo esperimento, si potrebbe vedere una netta separazione tra gli interactiani ad alta fiducia e >95% delle proteine copurificate identificate come non specifiche (Figura 2A,B). L’applicazione sia di un arricchimento del cambiamento di piega che di una soglia di probabilità aumenta la cordenza richiedendo un arricchimento costantemente elevato degli ID proteici tra le repliche biologiche. Oltre al punteggio statistico, il flusso di lavoro di analisi CRAPome mappa anche le interazioni precedentemente segnalate sui dati bait-prey23. Anche se questa mappatura può essere utile per thresholding interazioni di alta e bassa confidenza, le interazioni segnalate in precedenza possono ottenere un punteggio scarso dalle probabilità FC-A e SAINT, indicando potenzialmente che molte interazioni note di una determinata esca possono esistere solo in tipi di cella, contesti o organelle specifici. Per il set di dati DYRK1A di esempio, i valori dell’interazione iREF FC-A erano a partire da 0,45, il che rappresenta un arricchimento molto basso rispetto al controllo (Figura 2C). Per evitare l’inflazione di falsi positivi, le soglie statistiche dovrebbero essere eseguite in modo da dare priorità al rigore rispetto alla riduzione dei falsi negativi. Va notato che il rilevamento di queste interazioni era indipendente dall’abbondanza di proteine (Figura 2C). Il numero di copia assoluta calcolato di ogni interazione iREF all’interno delle celle HeLa non ha mostrato alcuna correlazione ai livelli di rilevamento di un partner di interazione da parte di IP-MS24. Cytoscape funge da strumento efficace per la visualizzazione di più livelli di dati di interazione19. Nell’esperimento di immunoprecipitazioni DYRK1A descritto qui, l’uso combinato di FC-A > 3.0 e SAINT > 0,9 ha ridotto l’elenco degli interattori ad alta fiducia a sei proteine (Figura 2D). Tuttavia, quando si applica un FC-A cutoff di > 3.0 in isolamento, otto proteine aggiuntive sono state aggiunte alla rete. Questi ulteriori interactiani proteici hanno un’elevata connettività con gli interactiani già presenti nella rete, suggerendo che sono associati in complessi o ruoli funzionali simili. A tal fine, l’evidenza del STRING-DB delle interazioni proteina-proteina è stata integrata in questa rete come linee tratteggiate blu20. Mentre questo esperimento a singolo esca e triplice fornisce un campione limitato dell’intera rete di interazione DYRK1A, l’uso di esche aggiuntive, repliche e l’integrazione di grandi set di dati pubblici può essere utilizzato per espandere la rete di interazioni ad alta fiducia. I tagli statistici saranno quindi specifici per ogni singolo esperimento e dovranno essere valutati a fondo. Figura 1: flusso di lavoro proteomico rappresentativo per IP-MS subcellulare. Le cellule vengono coltivate in flaconi di fondo rotondi da 4 L o in piatti di coltura tissutale da 15 cm e raccolte contemporaneamente per la frazione subcellulare. Le cellule sono frazionate in un citosolico, nucleare, e un pellet nucleare, e le immunoprecipitazioni sono fatte da 1/10 mg di lisato nucleare utilizzando uno o più anticorpi che riconoscono la stessa esca. La preparazione dei campioni con supporto per il filtro (FASP) e la pulizia dei campioni offline vengono eseguite prima della spettrometria di massa a singola ripresa. Una pipeline di calcolo a valle viene utilizzata per elaborare i dati in dati di interazione interpretabili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Dati rappresentativi per un esperimento IP-MS mono-esca mono-esca. (A) Uscita di probabilità FC-A e SAINT dal flusso di lavoro di analisi CRAPome per un esperimento ottimale utilizzando un singolo anticorpo per la chinasi DYRK1A (n – 3). Per il confronto sono stati utilizzati controlli solo per perline. Le linee continue rosse rappresentano i tagli impostati su FC-A > 3.00 e SAINT > 0.7. (B) L’output delle proteine MaxQuant (iBAQ) rispetto al rapporto log2 tra l’abbondanza proteica nell’IP DYRK1A al controllo, colorato dalla gamma di valori p regolati dall’analisi empirica di Bayes delle intensità prive di etichetta. (C) FC-A e numero stimato di copie delle proteine elencate come proteine interagenti nel database iRef23,24. (D) Visualizzazione rete Cytoscape degli interactiani DYRK1A. Nodi blu: FC-A > 3.00, SAINT > 0.7. Nodi arancioni: FC-A > 3,00. Bordi neri: proteine identificate come interactrissi nell’esperimento IPMS. Bordo tratteggiato blu : interazione SAINT tra le proteine della preda (confidenza > 0,150). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Miscela di inibitore della proteasi (PI) Reagente Concentrazione finale Metabisulfite di sodio 1 mM Benzamidine 1 mM Dithiothreitol (DTT) 1 mM Fluoruro Phenylmethanesulfonyl (PMSF) 0,25 mM Miscela di Phosphatase Inhibitor (PhI) Reagente Concentrazione finale Microcistia LR 1 M Orthovanadate di sodio 0,1 mM Fluoruro di sodio 5 mM Buffer di frazionamento subcellulare: Buffer A pH 7,9 Reagente Concentrazione finale HEPES 10 mM MgCl2 1,5 mM Kcl 10 mM Buffer B pH 7,9 Reagente Concentrazione finale HEPES 20 mM MgCl2 1,5 mM Nacl 420mm Acido etilenediaminetraace (EDTA) 0,4 mM Glicerolo 25% (v/v) Buffer C pH 7,9 Reagente Concentrazione finale HEPES 20 mM MgCl2 2 mM Kcl 100 mM Acido etilenediaminetraace (EDTA) 0,4 mM Glicerolo 20% (v/v) Buffer di immunoprecipitazioni: Buffer IP 1 Reagente Concentrazione finale HEPES 20 mM Kcl 150mm Edta 0,1 mM NP-40 0,1% (v/v) Glicerolo 10% (v/v) Buffer IP 2 Reagente Concentrazione finale HEPES 20 mM Kcl 500 mM Edta 0,1 mM NP-40 0,1% (v/v) Glicerolo 10% (v/v) SDS Alkylation Buffer pH 8.5 Reagente Concentrazione finale Sds 4% (v/v) Cloroacetamide 40 mM TCEP (TCEP) 10 mM Tris 100 mM UA pH 8,5 Reagente Concentrazione finale Urea 8 M Tris 0,1 M – utilizzare HPLC grado H2O Tabella 1: Composizioni del buffer File di codifica supplementari. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il flusso di lavoro proteomica qui delineato fornisce un metodo efficace per identificare gli interattori proteici ad alta fiducia per una proteina di interesse. Questo approccio riduce la complessità del campione attraverso la frazione subcellulare e si concentra sull’aumento dei partner di interazione di identificazione attraverso una solida preparazione del campione, la pulizia dei campioni offline e il rigoroso controllo di qualità del sistema LC-MS. L’analisi dei dati a valle descritta qui consente una semplice valutazione statistica delle proteine identificate come copurificanti con l’esca. Tuttavia, a causa di un numero elevato di variabili sperimentali (scala, linea cellulare, scelta degli anticorpi), ogni esperimento richiede diversi tagli e considerazioni riguardanti la visualizzazione e l’arricchimento dei dati.

La prima considerazione progettuale in un esperimento IP-MS è la selezione di anticorpi che saranno utilizzati per la copurificazione della proteina di interesse insieme ai suoi partner che interagiscono. Mentre la disponibilità di anticorpi commerciali si è espansa per coprire porzioni più grandi del proteoma umano negli ultimi decenni, ci sono ancora molte proteine per le quali i reagenti sono limitati. Inoltre, gli anticorpi che sono stati convalidati per applicazioni come il rilevamento delle macchie occidentali possono essere incapaci di arricchire selettivamente la proteina bersaglio in un esperimento di immunoprecipitazioni. Prima di condurre un esperimento proteomico di interazione su larga scala, si consiglia di completare un IP da un piatto di 10 cm confluente del 90%, o numero di cellule equivalente, e sondare la proteina bersaglio di interesse mediante gonfiore occidentale. Se più di un singolo anticorpo è disponibile per l’immunoprecipitazioni, si consiglia inoltre di selezionare più anticorpi che riconoscono gli epitopi all’interno di diverse porzioni della proteina. Il legame di un anticorpo a una proteina esca può occludere l’interfaccia di legame necessaria per i partner interagenti putativi. La selezione di un epitopo secondario per la proteina esca aumenterà la copertura del profilo di interazione identificato da un esperimento basato sulla spettrometria di massa.

Una seconda considerazione importante consiste nella scelta del controllo appropriato per distinguere le interazioni ad alta fiducia da quelle identificate come copurie con l’esca. Il controllo più rigoroso per un esperimento IP-MS è quello di completare l’immunoprecipitazioni da una linea cellulare CRISPR KO dell’esca. Tale controllo consente l’identificazione e il filtraggio di proteine non specifiche che si legano direttamente all’anticorpo piuttosto che alla proteina esca. Nei casi in cui la generazione di una linea cellulare CRISPR KO di ogni proteina esca non è fattibile, può essere utilizzato un controllo IgG-perline dello stesso isotipo dell’anticorpo dell’esca. Negli esperimenti che utilizzano un gruppo di anticorpi che rappresentano più specie, l’uso di un controllo solo perline può essere appropriato, ma aumenterà il tasso di falsi positivi identificati come interattori ad alta fiducia.

La selezione della linea cellulare utilizzata in un esperimento IP-MS dipende da diversi fattori chiave. L’espressione proteica e la localizzazione dipendono in gran parte dal tipo di cellula. Mentre le stime dell’espressione dell’RNA possono essere trovate per la maggior parte dei geni in molte linee cellulari comunemente utilizzate, l’espressione della proteina è scarsamente correlata all’espressione dell’RNA e deve essere determinata sperimentalmente²⁵. Le linee cellulari in cui una proteina esca è espressa in un numero di copie molto basso dovrebbero essere evitate per eludere i problemi associati a drastici aumenti della scala di coltura cellulare che potrebbero essere necessari. Va notato, tuttavia, che la preparazione del campione può essere ottimizzata per il rilevamento di proteine a bassissima abbondanza. Il metodo di preparazione del campione con aiuto filtrante (FASP), sebbene robusto, può causare una perdita di peptide superiore al 50% in un campione. Il Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) è un metodo efficiente di generazione di campioni per l’analisi della spettrometria di massa che riduce al minimo la perdita di campioni²⁶. L’aumento del recupero consentito dal metodo SP3 di preparazione del campione può essere un’utile alternativa in questo flusso di lavoro per la quantificazione delle proteine che si avvicinano al limite del rilevamento.

Questo flusso di lavoro proteomica è stato applicato in molte esche nucleari, tra cui chinasi, legamenti di ubiquitina E3 e membri di impalcature di complessi multisubunit. Supponendo una corretta convalida dei reagenti anticorpi, la corretta esecuzione di questo flusso di lavoro comporterà il rilevamento di partner di interazione nucleare di proteine ad alta fiducia per una proteina di interesse.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio Grand Challenge a W.M.O. dalla sindrome di Linda Crnic Institute for Down e da un accordo di cooperazione DARPA 13-34-RTA-FP-007. Vorremmo ringraziare Jesse Kurland e Kira Cozzolino per il loro contributo nella lettura e nel commento del manoscritto.

Materials

0.25% Trypsin, 0.1% EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	4561096
acetone (HPLC)	Thermo Fisher Scientific	A949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column	Millipore Sigma	UFC503096
Benzamidine	Sigma-Aldrich	12072
benzonase	Sigma-Aldrich	E1014
Chloroacetamide	Sigma-Aldrich	C0267
Dialysis tubing closure	Caroline Biological Supply Company	684239
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47724
Glycerol	Fisher Scientific	887845
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
HeLa QC tryptic digest	Pierce	88329
HEPES	Fisher Scientific	AAJ1692630
insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014
iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
KONTES Dounce homogenizer 7 ml	VWR	KT885300-0007
Large Clearance pestle 7ml	VWR	KT885301-0007
Lysyl endopeptidase C	VWR	125-05061
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	208337
Microcystin	enzo life sciences	ALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Substitute solution	Sigma-Aldrich	98379
p84 antibody	GeneTex	GTX70220
Phosphate Buffered Saline
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Pierce BSA Protein Digest, MS grade	Thermo Fisher Scientific	88341	LCMS QC
Pierce C18 spin columns	Thermo Fisher Scientific	PI-89873
Pierce Trypsin Protease, MS Grade	Thermo Fisher Scientific	90057	For mass spectrometry sample prep
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Protein A Sepharose CL-4B	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Bio-Sciences	17-0618-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Silica emitter tip	Pico TIP	FS360-20-10
Small Clearance pestle 7ml	VWR	KT885302-0007
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	201154
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing	Thomas Scientific	3787K17
TC Dish 150, Standard	Sarstedt	83.3903	Tissue culture dish for adherent cells
TCA	Sigma-Aldrich	T9159
TCEP	Thermo Scientific	PG82080
TFA	Thermo Fisher Scientific	28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS	Thermo Fisher Scientific
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Urea	Thermo Fisher Scientific	29700
Waters ACQUITY M-Class UPLC	Waters
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm)	Waters	186007484	nanoflow C18 column

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Cite This Article

Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old, W. M. Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling. J. Vis. Exp. (153), e60432, doi:10.3791/60432 (2019).