Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Der Zebrafisch ist seit langem ein Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie, und die Mikroskopie ist die wichtigste Methode, um die embryonale Entwicklung zu visualisieren. Die Vorteile der Verwendung von Zebrafischembryonen für Entwicklungsstudien sind geringe Größe, optische Klarheit, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit der erwachsenen Fische. Die Erzeugung transgener Zebrafischlinien, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen exdrücken, hat eine direkte Visualisierung der Gewebeentwicklung auf eine Weise ermöglicht, die bei größeren Wirbeltieren nicht möglich ist. In Kombination mit der Zeitraffermikroskopie lassen sich Details und Dynamiken der Gewebeentwicklung leicht untersuchen.

Ein Problem bei der Bildgebung der Zebrafischentwicklung ist, dass die Embryonen erheblich in der Länge wachsen; der Embryo verlängert seine Länge viermal innerhalb der ersten 3 Tage des Lebens¹. Auch der Körper des frühen Embryos ist weich und wird leicht verzerrt, wenn das Wachstum eingeschränkt wird. Doch um eine konfokale Mikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Um Embryonen in einer festen Position für konfokale Zeitraffer-Bildgebung zu halten, werden sie regelmäßig beäscht und in 0,3-1% niedrigschmelzender Agarose montiert. Dies hat den Vorteil, dass während der Bildgebung für einen bestimmten Zeitraum ein gewisses Wachstum ermöglicht wird, während gleichzeitig die Bewegungen des Embryos eingeschränkt werden. Teile des Embryos können effizient so abgebildet werden. Bei der Verwendung dieser Methode zur Bildgebung des gesamten Embryos über einen längeren Zeitraum werden jedoch Verzerrungen aufgrund des durch die Agarose verursachten eingeschränkten Wachstums beobachtet. Daher sind weitere Montagemethoden erforderlich. Kaufmann und Kollegen haben eine alternative Montage von Zebrafischembryonen für die Lichtbogenmikroskopie beschrieben, wie z.B. die selektive Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), indem die Embryonen in fluorierten Ethylenpropylen (FEP)-Röhren montiert werden, die geringe Konzentrationen von Agarose oder Methylcellulose²enthalten. Diese Technik erzeugt eine hervorragende Visualisierung der Embryogenese im Laufe der Zeit. Schmid et al. beschreiben die Montage von bis zu sechs Embryonen in Agarose in FEB-Röhren für die Lichtbogenmikroskopie^3, die die Visualisierung mehrerer Embryonen in einer Bildgebungssitzung ermöglicht. Formen wurden verwendet, um Embryo-Arrays für die effiziente Montage einer größeren Anzahl von Embryonen zu erstellen⁴. Masselkink et al. haben 3D-gedruckte Kunststoffformen konstruiert, die verwendet werden können, um Siliziumgüsse herzustellen, in denen Zebrafischembryonen in verschiedenen Stadien platziert werden können, was die Montage in einer konstanten Position für die Bildgebung ermöglicht, einschließlich konfokaler Bildgebung⁵. 3D-Druck wurde auch verwendet, um Formen für die konsistente Positionierung von Zebrafisch-Embryonen im 96-Well-Format⁶zu machen. Einige Formen sind für bestimmte Stufen angepasst und erlauben möglicherweise nicht uneingeschränktes Wachstum für längere Zeiträume, während andere Formen flexibler sind. Vor kurzem veröffentlichten Weijts et al. das Design und die Herstellung einer Vier-Brunnen-Schale für die Live-Bildgebung von Zebrafisch-Embryonen⁷. In dieser Schale werden Schwanz und Rumpf von anästhesierten Fischembryonen manuell unter einem klaren Silikondach platziert, das knapp über einem Deckglas befestigt ist, um eine Tasche zu bilden. Der Embryo wird dann in dieser Position durch die Zugabe von 0,4% Agarose fixiert. Diese Montage ermöglicht die Abbildung des etwa 2 mm langen hinteren Teils (Stamm und Schwanz) des Embryos, und da bis zu 12 Embryonen pro Bohrgut montiert werden können, ermöglicht das Verfahren die Abbildung mehrerer Proben. In ähnlicher Weise präsentierten Hirsinger und Steventon vor kurzem eine Methode, bei der der Kopf des Fisches in Agarose montiert ist, während der Schwanz frei wachsen kann, und diese Methode erleichtert auch effizient die Bildgebung des Rumpf- und Schwanzbereichs des^{Embryos 8}.

Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Bewegungen der Embryonen einschränken und gleichzeitig ein uneingeschränktes Wachstum ermöglichen. Die Vorteile dieser Montagemethode sind, dass es sich um eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode zur Montage von Embryonen verschiedener Stadien für die Bildgebung mit jedem invertierten Mikroskop handelt. Die Montage ermöglicht eine langzeitige Bildgebung des ganzen Körpers (Kopf, Rumpf und Schwanz) während der Embryoentwicklung. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu zeigen, wurde die entwicklung von ganzen Embryonastagen, Neuronalen und Muskeln in transgenen Fischen dargestellt. Zwei Embryonen pro Sitzung, bei zwei Wellenlängen in 3D, wurden durch Zeitraffermikroskopie für 55 aufeinander folgende Stunden abgebildet, um Filme der Gewebeentwicklung zu rendern.