تصوير المشبك المناعي البشري
Summary
صور هذا البروتوكول كلا من تشكيل المشبك المناعي وحركه المرور المستقطبة اللاحقة نحو المشبك المناعي. وشكلت الاقترانات الخلوية بين خليه راجي الفائقة النبض (التي تعمل كخليه لتقديم مستضد) واستنساخ Jurkat (بوصفها المساعد المستجيب T اللمفاوية).
Abstract
والغرض من هذه الطريقة هو توليد المشبك المناعي (IS) ، مثالا علي اقتران خليه إلى خليه شكلتها خليه تقديم مستضد (APC) والخلية اللمفاوية T (Th) المساعد ، ولتسجيل الصور المقابلة للمراحل الاولي من هو تشكيل واحداث الاتجار اللاحقة (التي تحدث في APC وفي الخلية ث). وسوف تؤدي هذه الاحداث في نهاية المطاف إلى إفراز الاستقطاب في IS. في هذا البروتوكول ، طعنت خلايا Jurkat مع المكورات العنقودية المعوية E (انظر)-نبض الخلايا الراجي كما تم استخدام نموذج المشبك الخلية ، وذلك بسبب التقارب من هذا النظام التجريبي إلى الواقع البيولوجي (Th خليه APC الاقترانات متشابك). وينطوي النهج المعروض هنا علي اقتران الخلية بالخلية ، والحصول علي الفواصل الزمنيه ، والمجهر الفلوري الواسع النطاق (البعثة) ، تليها معالجه الصور (التفكيك بعد الاستحواذ). وهذا يحسن نسبه الاشاره إلى الضوضاء (الاستخبارات) من الصور ، ويعزز الدقة الزمنيه ، ويسمح لاكتساب متزامنة من عده فلوروتشروميس في الناشئة الاقترانات متشابك ويقلل من التبييض فلوري. الاضافه إلى ذلك ، يتم مطابقه البروتوكول بشكل جيد مع بروتوكولات تثبيت الخلية نقطه النهاية (بارافورمالدهيد ، الأسيتون أو الميثانول) ، والتي من شانها ان تسمح مزيد من تلطيخ المناعي والتحليلات. هذا البروتوكول هو أيضا متوافق مع المسح الضوئي بالليزر المجهر البؤري (LSCM) وغيرها من التقنيات المجهرية الدولة من بين الفن. كتحذير رئيسيه, فقط ان [ت] [سل-APC] حدود (يدعي [س] واجات) ان كان في ال يصح 90 ° زاوية إلى البؤرة طائره علي طول ال [ز-اكسيس] استطاع كنت بشكل صحيح [ايمسن] وحللت. توجد نماذج تجريبية أخرى تبسط التصوير في البعد Z وتحليلات الصور التالية ، ولكن هذه الطرق لا تحاكي السطح المعقد وغير المنتظم لناقله APC ، وقد تروج للتفاعلات غير الفسيولوجية في ال IS. التالي ، فان النهج التجريبي المستخدم هنا مناسب للإنتاج ولمواجهه بعض التعقيدات البيولوجية التي تحدث في المعرض.
Introduction
والهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو توليد المشبك المناعي (IS) الخلية إلى الخلية التي شكلتها خلايا العرض مستضد (APC) النبضي مع المولدات الخارقة انظر والخلية الثالثة المستجيب ، ولتسجيل الصور المقابلة للمراحل الاولي من تكوين المشبك المناعي واحداث الاتجار اللاحقة (التي تحدث في APC والخلية ث) ، والتي في نهاية المطاف سوف تؤدي إلى إفراز الاستقطاب في IS. إنشاء من قبل الخلايا الليمفاوية T عند ربط مستقبلات الخلية الخاصة بهم (TCR) للمستضدات المنضمة إلى mhc-II علي APC ينظم الحيوية للغاية ، طيع والحرجة التي تشارك في الاستجابات المناعية الخاصة مستضد ، الخلطيه والخلوية1،2. يتم تعريف is بواسطة تشكيل معقده التنشيط الجزيئية الخاصة (smac) نمط يتميز بعمليه أعاده تنظيم الاكتين3. علي IS البناء من الخلايا الليمفاوية T مع APC ، والاستقطاب من الحويصلات سيكريتوري نحو IS يبدو متورطا في إفراز الاستقطاب في الفجوة متشابك. ويبدو ان هذه اليه المركزة تزود الجهاز المناعي بشكل لا لبس فيه بحيله منظمه بطريقه رائعه لتعزيز فعاليه الأدوار الحاسمة التي تقوم بها الخلايا اللمفاوية التائية ، مع تقليل التحفيز غير المحدد للخلايا المارة ، وقتل الخلايا المستهدفة غير ذات الصلة ، والانتحار عن طريق التنشيط4.
نتيجة لل IS يختلف علي طبيعة كل من اللمفاوية T و APC. الاتصال متشابك من الخلايا العشر (عاده الخلايا + +) مع APC عرض المرتبطة antigen إلى MHC-II تنتج تنشيط الخلية T (إفراز السايسيسين ، والانتشار ، وما إلى ذلك) ، وفي بعض الحالات ، المبرمج عن طريق AICD4. للخلايا اللمفاوية T السامة (CTLs) (أساسا CD8 + الخلايا) التفاعل مع APC تقديم مستضد المرتبطة MHC-I ، تختلف النتيجة علي ما قبل التحفيز ام لا من CTLs مع مستضد. وهكذا ، CTLs ساذجه تحديد المجمعات antigen-MHC-I علي APC هي “تستعد” لتدمير الخلايا المستهدفة والانقسام. تستعد ctls أيضا إنشاء الاشتباكات العصبية مع الخلايا المستهدفة (اي الخلايا المصابة بالفيروسات أو الخلايا السرطانية) التي تنتج مستضد خليه خاصه الاباده5,6.
إفراز الاستقطاب من التماثيل في المشبك المناعي هو مجال النامية والتحدي من البحوث المعنية في الاستجابات المناعية ذات الصلة7. وقد ثبت ان الهيئات متعددة الحويصلات (mvb) تحمل الحويصلات داخل ألومنيوم (ilvs) تجربه النقل المستقطب نحو IS8,9 (فيديو 1) علي تحفيز TCR مع مستضد. الانصهار من هذه mvb في غشاء متشابك يدفع بهم التحبيب والإفراج عن ilvs كما exosomes إلى المشقوق متشابك8,10. يحدث هذا في IS التي شكلتها الخلايا من النوع الذي تم تحديه مع الخلايا الراجية انظر المغلفة سوبرمستضد التي تعمل باسم APC11، وحفزت TCRاللمفاويات اللمفية ، وتستعد ctls. وهكذا ، فان الاشتباكات العصبية التي قدمتها الخلايا Jurkat تشكل نموذجا قيما لدراسة الاستقطاب سيكريتوري حركه المرور من exosomes. الاضافه إلى ذلك ، أظهرت عده عقود من التحقيق ان العديد من الرؤى الاساسيه في الإشارات TCR جاءت من الدراسات مع تحويل خطوط الخلايا التائية ، وفي الواقع أفضل المعروفة من هذه النظم نموذج هو الكريات البيضاء الخلايا البيضاء T-خليه خط12.
وينتج تشكيل التطوير الكامل العديد من النتائج البيولوجية الحاسمة ، بما في ذلك تنشيط الخلايا العشر ، وتفعيل CTLs الساذجة أو قتل الخلايا المستهدفة بواسطة CTLs الجاهزة ، باستثناء انرجي أو AICD5. ولذلك ، هناك نوعين رئيسيين من سيكريتوري يتم تاسيسها من قبل الخلايا الليمفاوية T التي تؤدي في متنوعة جدا ، ولكن الحرجة بالمثل ، وظائف المناعي المستجيب1،6،13. من ناحية ، و IS من تستعد الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (CTLs) يدفع الاستقطاب السريع (تتراوح بين ثوان إلى بضع دقائق) من حبيبات الليتيك (تسمي “سيكريتوري lysosomes تماثيل”) نحو IS. التحبيب من حبيبات التحللي يحفز إفراز تثقيب و granzymes إلى المشقوق متشابك14، والتي هي جزيئات الموالية ابوتوتيك. ال يفرز يثقب و [غرزيميس] في وقت لاحق يحث قتل من الخلايا مستهدفه15,16. Ctls تطوير الاشتباكات العصبية المؤقتة ، وتستمر لبضع دقائق فقط ، كما يتم قتل الخلايا المستهدفة3،17. هذا هو علي الأرجح بسبب الظرف ان المهمة CTL الأمثل يتطلب الاتصال السريع والمؤقت من أجل توزيع أكبر عدد ممكن من الضربات المميتة إلى العديد من الخلايا المستهدفة3,17. وعلي النقيض من ذلك ، فان الخلايا اللمفاوية الليمفاوية ، مثل زنزانات jurkat ، تولد مستقره وطويلة الأمد (من 10-30 دقيقه حتى ساعات) ، لان هذا يبدو ضروريا لكل من الإفراز الاتجاهي والمتواصل لتحفيز السايتوكينات3،17. كما يتم تضمين السايتوكينات في حويصلات سيكريتوري وبعضها (اي ، IL-2 ، IFN-γ) تجربه النقل المستقطب إلى IS17 وإفراز. واحده من السمات الاساسيه لل IS هو تشكيل الاتصالات الاستكشافية والضعيفة وعابره بين الخلية T و APC (فيديو 1) التي قد تنتج تفاعلا اقوي وإنشاء IS ناضجه ، شريطه ان يحدد TCR المجمعات antigen-mhc المتشابهة وان يتم تاسيس اتصالات التحفيز المشترك المناسبة5. كل من بداية الاتصالات الاوليه وتاسيس ناضجه ، منتجه تماما ، هي بطبيعتها العشوائية ، والعمليات السريعة وغير المتزامنة5،18. وعلاوة علي ذلك ، هناك تردد نادر في إنشاء الاقترانات من الخلية إلى الخلية19، والتي قد تشكل تحديا لتقنيات التصوير (يرجى الرجوع إلى أقسام النتائج والمناقشة).
ومن التحديات الرئيسية الأخرى في دراسة الاستقطاب في مركز التنظيم المجهري (MTOC) والحبيبات التي تفرزها الخلايا اللمفاوية التائية ان العملية برمتها سريعة (من ثوان إلى بضع دقائق) ، لا سيما في CTLs. النظر إلى هذه الحقائق ، واجهت معظم النهج المبكرة استراتيجية النقطة النهائية التي تختلط فيها الخلايا APC/المستهدفة واللمفاويات التائية بصوره مشتركه ومتقاربة بطرد السرعة المنخفضة ، لصالح الإنشاء المترافق بين الخلايا ، المحتضن لعده دقائق نقل من [متك] [و/ور] حويصلات [سيكريتوري] نحو ال [س]20. وهذا النهج له حدودان هامه: لم يتم التوصل إلى بيانات حيه عن الاتجار بالبشر وتم الحصول علي مستويات عاليه من الاستقطاب لحبيبات MTOC/سيكريتوري ، ربما بسبب الطابع العشوائي لمؤسسه IS18. وعلاوة علي ذلك ، اي ارتباط بين المحفزة TCR ، الاحداث الإشارات الاوليه (اي ، يرتفع الكالسيوم داخل الخلايا ، أعاده التنظيم الاكتين) والاستقطاب الحويصلة الإفراز إشكاليه للتحقيق. التالي ، فان الاحكام الحتمية للتصوير المناسب لل IS في الخلايا الحية تجتمع لتعزيز التجسيد المقارن بين الخلايا ، لمزامنة جيل ال IS ، وعند الإمكان ، لضمان إنشاء الاقتران الخلوي في حقول XY المجهر المحددة ومواضع Z. وقد وضعت عده استراتيجيات لتجنب كل هذه المشاكل. ومن الخارج عن نطاق هذه الورقة شرح هذه الأساليب وفوائدها ونقاط ضعفها. يرجى الرجوع إلى الاستعراضات المنشورة سابقا معالجه هذه النقاط الهامه1،4،5،21.
الحقيقة التي ادلي بها الخلايا الليمفاوية Th هي طويلة الأمد ، والظرف الذي في الخلايا الليمفاوية ال MTOC ، اللمفاوية التي تحتوي علي حبيبات سيكريتوري و MVB تاخذ من عده دقائق تصل إلى ساعات للتحرك وقفص الاتهام لل IS22 يجعل TH-APC هو مرشح مثالي للتصوير باستخدام البروتوكول الموصوف هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
والحد من هذا البروتوكول هو ان ليس كل الاشتباكات العصبية سوف تكون موجهه بشكل مثالي عمودي علي المحور البصري. باستخدام هذه التقنية ، لا توجد طريقه للتنبؤ و/أو التاثير علي الاتجاه المثالي لتصوير المشبك المناعي. لحل هذه المشكلة ، ونحن استبعاد من التحليلات اللاحقة جميع الاشتباكات العصبية التي تم التقاطها عشوائيا انه في النهاية لا تستوفي المعايير المثالية. هذه الاشتباكات العصبية ، بما فيه الكفاية ، ليست متكررة جدا. ومع ذلك ، فمن الممكن التفاف علي هذا القيد باستخدام العديد من النهج التجريبية4.
ويمكن قياس الإفراج عن CD63 الاستقطاب (التحبيب) بواسطة تقنيات تكميليه أخرى مثل تلطيخ سطح الخلية من CD63 (CD63 أعاده التوطين إلى سطح الخلية) في الخلايا الحية (غير ثابته وليست تتخلل) ، بعد الخطوة 6 ، والغسيل والتثبيت اللاحقة ، كما هو مبين سابقا8. الاضافه إلى ذلك ، CD63 الإفراج عن exosomes تماثيل8،9 و exosomes القياس الكمي من قبل جسيمات متناهي تتبع التحليلات9،25 يمكن ان يؤديها. هذه النهج هي بالتاكيد متوافقة مع البروتوكول الخاص بنا ، شريطه ان يتم تنفيذ التثبيت بعد المناعي سطح الخلية من الخلايا الحية.
لقد وجدنا العدد المثالي من الخلايا (ل 1 سم2 جيدا في الشريحة 8-بئر الغرفة) هو 4 × 105 خلايا (2 × 105 خلايا راجي و 2 × 105 jurkat الخلايا) لأنها تلتزم بكفاءة إلى الجزء السفلي من البئر. ربط الكفاءة إلى البلاستيك (باستخدام الفيبروكتين) ، أو أسفل الزجاج (باستخدام بولي-L-يسين) ميكروروليدس ليست عاده مشكله. وقد تؤدي الأرقام الأعلى للخلايا إلى عدم وجود فجوات بين الخلايا الملتصقة ، ومن ثم الاقترانات المتشابكة المعقدة (الشكل 1) ؛ كلا الحالتين غير مرغوب فيها عند الاقتران خليه إلى خليه واحده تحتاج إلى ان تكون في العمر ، علي سبيل المثال ، MTOC أو التجارب الاستقطاب الحبيبية سيكريتوري. انخفاض عدد الخلايا قد يقلل من فرص العثور علي الاقتران ، وخاصه عندما يتم تحدي الخلايا Jurkat المقسمة مع APC لتوليد الاشتباكات العصبية. يرجى ملاحظه اننا لاحظنا ان حاضنه مرحله درجه الحرارة استقرت في مكان علي المجهر X/Y المرحلة قبل بداية البروتوكول (اي ، 1-2 h مقدما لتحقيق الاستقرار في المرحلة/المجهر الاعداد) يحافظ علي مستقره X ، Y ، Z المعلمات ، وهو أمر حاسم للتصوير السليم. سيعوض نظام التركيز التلقائي في نهاية المطاف الاختلافات Z الصغيرة.
عندما تستخدم بعض تقنيات المحولات الجينية مثل الكهربية للتعبير عن بروتينات تشيريك الفلورسنت (اي CD63) في المستنسخات Jurkat (فيديو 1) ، قد يموت جزء كبير من الخلايا بعد الكهربية. وهذا يمكن ان يكون مشكله لأنه علي الرغم من ان الخلايا الميتة لا تشكل الاشتباكات العصبية ، وعندما تكون في الزائدة علي الخلايا الحية ، التي تحولت ، فانها قد تتداخل مع تشكيل التصريفات التي ادلي بها الخلايا الحية ث. لقد وجدنا ان القضاء الدقيق علي الخلايا الميتة من الثقافات المقطوعة باستخدام متوسط التدرج الكثافة التالية البروتوكولات القياسية قبل خطوه تشكيل المرافقة يمكن ان تزيد في الواقع فرص لصوره بشكل صحيح الاقتران. الاضافه إلى ذلك ، انخفاض كفاءه التحويل (< 20 ٪) يمكن ان يكون تحذيرا مهما لان هذا ، جنبا إلى جنب مع كفاءه تشكيل المقارن المعتدل (حوالي 60 ٪)25، سوف يقلل من احتمال العثور علي الاقترانات التي ادلي بها الخلايا المحولة. هذه ليست مشكله عندما يتم استخدام الخلايا غير المحولة للحصول علي التصريفات في التجارب نقطه النهاية والتثبيت اللاحقة. الشرائح 8 microwell الغرفة متوافقة مع البروتوكولات المناعية التقليدية. وهذا يزيد من مرونة البروتوكول المذكور أعلاه لأغراض مختلفه. التثبيت مع الأسيتون يمكن ان يكون مشكله في الاعتبار عند استخدام الشرائح الغرفة مع الآبار البلاستيكية القاع. ومع ذلك ، هناك متاحه تجاريا 8 microwell الشرائح المجهر الغرفة التي تحتوي علي قيعان الزجاج ، والتي هي متوافقة مع تثبيت الأسيتون. قم بازاله الاغطيه البلاستيكية عند استخدام الأسيتون لإصلاح الخلايا المستزرعة في 8 شرائح الحجرة الزجاجية السفلية الصغيرة.
فمن المستحسن ان يتم تجهيز المجهر مع المرحلة XY الميكانيكية ، والمحركات برج التحصين الموسع-فلوري ونظام التركيز التلقائي (علي سبيل المثال ، نظام التركيز المثالي) أو ملاحق ما يعادلها. عندما يتطلب الاستحواذ المتعدد الآبار25، فان نظام التركيز التلقائي سيضمن التركيز الثابت علي طول التجربة. وتشير التجربة السابقة إلى انه من خلال إنشاء أزاحه التركيز المناسبة علي خلايا راجي ، قد يتم تعويض كل من حركه الخلايا التائية (الفيديو 1) وحركات شريحة المرحلة/الغرفة المجهر في التجارب المتعددة النقاط XY. هذا هو في الواقع مريحه للتقاط الفاصل الزمني المتعدد البئر.
وقد استخدمت كاميرا باللونين الأسود والأبيض ، والملونة والمبردة المشحونة إلى جانب (الجهاز) ولكن الحساسية العالية ، مضان العلمية التكميلية المعادن أكسيد أشباه الموصلات (sCMOS) الكاميرا هو مرغوب فيه ، لان هذا سوف يقلل من مرات التعرض للكاميرا ، مرات التعرض الكاميرا القصيرة التي استخدمناها (الترتيب شكل 100 مللي ثانيه إلى 500 مللي ثانيه) مع مصراع التلقائي مضان يسمح التقاط الفاصل الزمني لفترات طويلة (تصل إلى 24 ساعة) مع دقه الوقت المناسب (1 اطار في الدقيقة الواحدة أو اقل ، لمده تصل إلى 16 XY المواقف) المرحلة اليه يسمح متعدد نقطه (XY) التقاط ويزيد من فرصه للعثور علي وصوره الناشئة والنامية الاشتباكات العصبية في الاتجاه المثالي ، ولكن أيضا يسمح اكتساب الصورة في الشرائح الغرفة المتعددة عندما استنساخ Jurkat مختلفه تحتاج إلى ان تكون في وقت واحد مترافق25. الفتحة العددية العالية للهدف (اي 60x ، 1.4) ضرورية من أجل الحصول علي أفضل النتائج عند تحليل حركه المرور من حبيبات سيكريتوري.
الراجي-انظر-Jurkat يشكل نموذجا المشبك المناعي الراسخة التي تم استخدامها من قبل عدد لا يحصي من الباحثين منذ ان وصفت أصلا11. لقد قمنا بتكييف بروتوكولنا لهذا النموذج من أجل صوره صحيحه في المراحل المبكرة من تشكيل IS. وكان هدفنا هو تحسين النهج المبكرة20 التي اتبعت سابقا لدراسة الاستقطاب من mtoc وآلات سيكريتوري نحو IS. ومن اللافت ان الاقترانات المصنوعة من هذا البروتوكول تنتج F-actin أعاده التنظيم في المشبك ، وتكوين SMAC الكنسي ، في الوقت ذاته إلى حركه المرور المستقطبة MVB25. وتم أيضا تحليل هذه الاحداث الحاسمة والتحقق من صحتها بواسطة المجهر البؤري25.
يتواجد فروق حركيه في حركه مرور مستقطبه بين أنواع مختلفه من [هو]. علي سبيل المثال ، يتم النقل المستقطب لحبيبات الليتيك من CTLs في ثوان معدودة أو دقائق قليله جدا ، في حين ان العديد من الحويصلات المحتوية علي السايسيسيني من الخلايا اللمفاوية التائية تاخذ من دقائق تصل إلى عده ساعات حتى النهاية. يجب ان تؤخذ هذه الاختلافات الزمنيه في الاعتبار مسبقا ، من أجل تصميم أفضل استراتيجية واختيار النهج الأكثر ملاءمة التجريبية والتصوير ، لأنه بالنسبة لبعض الصور الحيلة (اي المسح بالليزر المجهر البؤري (LSCM)) ، يمكن ان يكون الوقت عاملامقيدالان وقت التقاط هو اعلي بكثير من وهذا ليس قيدا عندما يستخدم المجهر الفلوري الواسع النطاق (WFFM) كما هو موصوف في البروتوكول أعلاه. منذ في ctls ، والاستقطاب من mtoc نحو المشبك يدوم سوي بضع دقائق3،6،17، الحالة الخاصة المختلفة-من المجهر الفن النهج المختلفة لتلك الموصوفة هنا (ولكن إيواء القرار المكانية والزمانيه اعلي) ضرورية من أجل صوره صحيحه هذه نقاط الاشتباك العصبي26،27، أساسا هذه عاليه الاستبانة, ويمكن أيضا استخدام النهج الجديدة للتصوير العصبية التي ادلي بها الخلايا الليمفاوية Th, علي الرغم من الأسباب الاقتصادية و/أو اللوجستية (اي, المعدات الاساسيه اللازمة لبعض من هذه التقنيات التصوير يكلف 6-7 مرات أكثر من واحد وصفها هنا) يمكن ان تشكل بالتاكيد حقيقة ان يتم التي ادلي بها اللمفاويات Th هي طويلة الأمد ، والظرف الذي في الخلايا الليمفاوية ال MTOC ، اللمفاويات التي تحتوي علي إفراز الحويصلات و MVB تاخذ من عده دقائق تصل إلى ساعات لنقل وقفص الاتهام إلى IS22، يجعل هذا البروتوكول هو الأمثل ، ونهج بأسعار معقول
وتشكل البعثة ، بالاقتران مع تفكيك الصورة بعد اكتسابها ، نهجا مثيرا للاهتمام ولا تدعم هذه الاستراتيجية الأسباب الاقتصادية فحسب. ويمكن تحسين القرار الفقراء المتاصله في المحور Z (التحذير الأكثر اهميه من هذه التقنية) باستخدام ما بعد الاستحواذ صوره تفكيك4 (قارن الفيديو 1 مع الفيديو 2). وتستخدم عمليه التفكيك طريقه معالجه الصور المستندة إلى الحساب ، والتي يمكن ان تحسن نسبه الاشاره إلى الضوضاء ودقه الصورة والتباين27 حتى 2 مره ، وصولا إلى 150-100 نانومتر في محور XY و 500 نانومتر في المحور Z4.
استخدام الحساسية العالية ، وسرعه قراءات عاليه ومجموعه ديناميكية واسعه ، والكاميرات الجديدة الفلورية sCMOS تحسين نوعيه الصور وسوف تقلل من التبييض فلوري. تسمح المرونة التي يوفرها بروتوكول اقتران الخلية بالخلية الموصوف هنا بالجمع بين النهج الخلوي الموصوف مع العديد من تقنيات المجهر الفني ، سواء في الخلايا الحية ولكن أيضا في الخلايا الثابتة ، والنتيجة المتوقعة سيحسن بالفعل معرفتنا بالمشبك المناعي.
علي الرغم من اننا قد نفذت والتحقق من صحة البروتوكول باستخدام سهله التعامل معها ، وخطوط الخلايا الراسخة ، والمحتمل ان النهج قد يسمح التصور للتفاعلات الفسيولوجية أكثر عندما يتم استخدام خلايا T الابتدائية وأنواع مختلفه من الخلايا العرض مستضد (مثل الخلايا الجذعية من الضام)5 في هذا السياق ، تم تمديد هذا البروتوكول أيضا والتحقق من صحتها باستخدام superantigen (سيب)-نابض الماوس EL-4 خط الخلية المستخدمة APC ، لتحدي الماوس الابتدائية T اللمفاويات9. في الواقع اللمفاويات الاوليه T ، CTLs علي وجه الخصوص ، وقدمت المزيد من الاتصالات القصيرة الأجل والحيوية متشابك (انظر الفيديو التكميلي 8 في المرجع9) لأولئك الذين ينظر اليهم مع نموذج انظر-راجي وجوركات. يمكن ان ينظر إلى تنوع وسائط الاتصال متشابك أفضل للتفاعلات الاساسيه T-الخلية مع الخلايا الجذعية أو الخلايا B في معادلات الانسجه في المختبر ثنائي الابعاد التي يمكن أيضا تسجيلها وتحليلها باستخدام هذا البروتوكول. الاضافه إلى ذلك ، وبصرف الفضل عن المستضدات ، يمكن استخدام هذه التقنية لصوره أنواع أخرى من الاشتباكات العصبية. علي سبيل المثال ، يمكن استخدامه في نموذج الخلية T المحورة وراثيا ، مستضد محدده ، علي سبيل المثال باستخدام ovalbumin محدده murine OT1/OT2 النظام أو عن طريق التحويل من الخلايا T مع مستقبلات الخلايا T مستضد محدده. وهذا يفتح عددا لا يحصي من الإمكانيات التجريبية للمستقبل القريب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف بجميع أعضاء المختبر السابقين والحاضرين علي مساهمتهم السخية. وقد دعم هذا العمل بمنح من الوزارة الاسبانيه للاقتصاد والمنافسة (MINECO) ، والخطة الوطنية للبحوث Científica (SAF2016-77561 إلى M.I. ، التي منحت جزئيا بتمويل من الاتحاد الأوروبي). نحن نعترف كليه الطب (UAM) و Departamento de أوديوفيسواليس من كليه الطب لدعمهم والتسهيلات المقدمة لإنتاج الفيديو. نحن نعترف بان نيكون-أوروبا للدعم التقني والنظري المستمر والرائع. الوصول المجاني إلى هذه المقالة برعاية نيكون.
Materials
| Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
| CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
| JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
| μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
| Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
| Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
| RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
| Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
| Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
| Software Image J | NIH | Image J | Image software |
| Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |
References
- Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
- de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
- Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
- Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684 (2018).
- Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
- Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
- Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
- Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
- Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
- Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
- de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
- Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235 (2012).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
- Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
- Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
- Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , 1 (2009).
- Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851 (2019).
- Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).
