Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen
Summary
Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.
Abstract
Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.
Introduction
Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.
Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.
Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die “konstante” Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
