Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)¹ e Parkinson (PD)² doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides^{3, 4}. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos^4,5.

Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear^{5, 6} anos de ^{, 7} anos de ^{, 8} . º ^{, 9}. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas⁸. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides^{5,6,7,10,11,12.} No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala^13,14.

Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro^{13,14,15,16,17,18,19, 20} anos de ^{, 21} anos de ^{, 22} anos de ^{, 23} anos de ^{, 24} de cada ^{, 25} anos de ^{, 26} anos de ^{, 27}. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides^{23, 25,38,39,40,41,42}. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40},^{43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48}. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.

Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional^24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm^-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR^{13,54 ,55}. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos⁵². Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.

Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.