Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

Plus de 40 millions de personnes dans le monde sont actuellement touchées par des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer (MA)¹ et la maladie de Parkinson (PD)² maladies. Plus généralement, plus de cinquante pathologies sont associées au niveau moléculaire à la méplication et à l’agrégation des protéines, un processus qui conduit à la prolifération d’agrégats insolubles de protéines fibrillaires, connus sous le nom de dépôts amyloïdes^{3, 4}. Les origines moléculaires de la neurodégénérescence et ses liens avec les changements conformationnels protéiques des protéines conduisant à la formation d’amyloïdes, cependant, restent incertaines, en grande partie en raison du niveau élevé d’hétérogénéité, de nature transitoire et de nanoéchelle dimensions des agrégats pathologiques^4,5.

Les études très réussies des structures protéiques au cours des dernières décennies ont été largement basées sur l’utilisation de méthodes en vrac, y compris la cristallographie aux rayons X, la microscopie cryo-électronique et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire^{5, 6} Annonces ^{, 7 Annonces , 8 Annonces , 9}. Dans cette catégorie de techniques, la spectroscopie infrarouge (IR) est apparue comme un outil d’analyse sensible pour démêler les propriétés chimiques des systèmes biologiques tels que les protéines⁸. Les méthodes d’IR permettent la quantification des changements structurels secondaires et quaternaires de protéine pendant leur malplier et agrégation. En outre, afin de déchiffrer davantage au niveau microscopique les détails mécanistes impliqués dans les paysages complexes d’énergie libre de protéines au cours de leur agrégation, une avancée majeure a été le développement d’outils de cinétique chimique pour s’étendre à la complexité voies d’auto-assemblage, y compris la formation de fibrilles amyloïdes^{5,6,7,10,11,12}. Cependant, les méthodes spectroscopiques en vrac ne fournissent que des informations moyennes sur l’ensemble hétérogène d’espèces présentes en solution ou impliquées dans des étapes microscopiques spécifiques, rendant ainsi l’étude des propriétés biophysiques des individus espèces agrégées défiant au niveau nanométrique^13,14.

Plusieurs techniques de microscopie avec la capacité de fonctionner sur des échelles plus petites que la limite de diffraction de la lumière ont émergé au cours des dernières décennies. Cette classe de méthodes comprend la microscopie électronique (EM) et la microscopie par force atomique (AFM). Alors que la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie électronique de transmission (TEM) fournissent des images bidimensionnelles (2D) d’un spécimen, l’AFM est apparue au cours des dernières décennies comme une technique puissante et polyvalente pour étudier les morphologies tridimensionnelles (3D), ainsi que les propriétés nanomécaniques d’un échantillon avec la résolution de sous-nanomètre^{13,14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22} Ans ^{, 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25} Annonces ^{, 26} Annonces ^{, 27}. La raison d’être de l’étude de l’agrégation des protéines par l’intermédiaire de l’AFM est que cette approche permet d’étudier la morphologie des espèces individuelles présentes dans la solution^{13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37}. En particulier, en surveillant l’échantillon en fonction du temps, l’AFM permet d’enquêter sur l’évolution de la morphologie de l’espèce au sein de l’échantillon, ce qui permet de suivre et de visualiser les voies de la formation amyloïde^{23, 25,38,39,40,41,42}. En outre, l’AFM permet de quantifier les paramètres structurels tels que les hauteurs transversales et les longueurs des espèces individuelles présentes dans la solution^{13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 Ans, en} est à qui ^{, 45} Annonces ^{, 46 Annonces , 47 Annonces , 48}. Cependant, l’étude d’une seule propriété biophysique, comme la morphologie, n’est souvent pas suffisante pour étudier des systèmes biologiques hétérogènes et complexes. Les méthodes d’imagerie AFM, SEM ou TEM à elles seules ne révèlent pas facilement les propriétés chimiques des espèces hétérogènes d’agrégats amyloïdes à l’échelle nanométrique.

Une avancée majeure pour l’analyse d’échantillons biologiques hétérogènes à cette échelle a été faite récemment avec le développement et l’application dans le domaine de l’agrégation de protéines de la nanospectroscopie infrarouge (AFM-IR)^{24,26, 38,42,49,50,51,52}. Cette méthode innovante exploite la combinaison de la résolution spatiale de l’AFM (1 à 10 nm) avec la puissance d’analyse chimique de l’IR. La technique AFM-IR est basée sur la mesure de l’effet de résonance induit par photothermale entraîné par un laser IR, et sur la mesure de l’expansion thermique de l’échantillon à l’étude par la pointe de l’AFM. L’échantillon peut être éclairé par le laser IR directement à partir du haut ou du bas en toute réflexion interne, de la même manière que dans la spectroscopie infrarouge conventionnelle^24,42,52,53 . Le laser IR peut être pulsé avec des fréquences typiques de l’ordre de centaines de kilohertz (1-1000 kHz) et réglé sur une large portée spectrale, généralement entre 1000-3300 cm^-1. Bien que la source laser couvre une superficie de 30 m de diamètre, la résolution spatiale de la technique AFM-IR est déterminée nominalement par le diamètre de la pointe AFM, qui détecte l’expansion thermique locale du système. L’AFM-IR est bien adapté pour étudier les échantillons biologiques parce que le signal IR est proportionnel à leur épaisseur jusqu’à 1,5 m, et les spectres IR qui en résultent sont généralement en accord avec les spectres de transmission FTIR correspondants^{13,54 ,55}. Pour cette raison, les méthodes d’analyse établies en spectroscopie peuvent être facilement appliquées, telles que l’étude des changements chimiques, le changement de forme de bande et la déconvolution par deuxième analyse des dérivés⁵². Dans l’ensemble, en combinant la résolution spatiale de l’AFM avec la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, l’AFM-IR permet l’acquisition simultanée d’un large éventail de propriétés morphologiques, mécaniques et chimiques d’un échantillon à l’échelle nanométrique.

Ici, nous illustrons un protocole pour la caractérisation du processus d’agrégation de protéines qui exploite la combinaison des essais de fluorescence in vitro, de l’imagerie AFM haute résolution et de l’AFM-IR à l’échelle nanométrique. Cette approche combinée a déjà excellé dans l’étude des résultats détaillés dans l’étude des propriétés chimiques et structurelles des microgouttes individuelles formées par les agrégats protéiques, dans l’étude de la séparation de la phase des protéines liquides-liquides, et dans étudier l’hétérogénéité et les propriétés biophysiques des espèces agrégées individuelles à l’échelle nanométrique^{23,26,38,45,50,53, 56,57}.