A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of <em>Aplysia californica</em>

Catherine Kehl; Hillel  J. Chiel

doi:10.3791/60030

JoVE Journal > Neuroscience

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신경과학

Une technique de lésion mini-invasive pour les muscles intrinsèques à l'odontophore d'Aplysia californica

Published: August 16, 2019

doi:

10.3791/60030

Catherine Kehl¹, Hillel J. Chiel^1,2,3,4

¹Department of Biology,Case Western Reserve University, ²Department of Biology,Case Western Reserve University, ³Department of Neurosciences,Case Western Reserve University, ⁴Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University

Summary

Ici nous présentons un protocole pour la lésion chirurgicale mini-invasive des muscles intrinsèques à l’appareil d’alimentation du mollusque marin Aplysia californica pour comprendre les rôles de ces muscles pendant le comportement d’alimentation.

Abstract

Aplysia californica est un système modèle pour étudier le contrôle neuronal de l’apprentissage et du comportement. Cet animal dispose d’un système circulatoire semi-ouvert, ce qui permet d’accéder à plusieurs de ses structures internes sans causer de dommages importants. De nombreuses manipulations peuvent être facilement effectuées in vivo et in vitro, ce qui en fait un modèle très traitable pour l’analyse du comportement et des circuits neuronaux. Pour mieux comprendre les fonctions des muscles au sein du grasper d’alimentation, nous avons développé une technique pour les lésionsans sans ouvrir la cavité corporelle principale de l’animal ou endommager les couches externes de l’organe d’alimentation (c.-à-d., la masse buccale). Dans cette technique, le grasper est partiellement everted, permettant un accès direct à la musculature. Cette procédure permet aux animaux de récupérer rapidement et de manière fiable. Cela a permis de lésion des muscles I7 et des fibres sub-radulaires, ce qui nous permet de montrer que les deux muscles contribuent de manière significative à l’ouverture in vivo.

Introduction

Le système d’alimentation de Aplysia californica a une longue histoire d’utilisation comme un système modèle pour comprendre l’apprentissage et la mémoire¹, les comportements motivés²^,³, et l’interaction entre le comportement, la biomécanique et contrôle neuronal pendant l’alimentation⁴. Il a des circuits neuronaux très accessibles, avec un nombre relativement faible de grands neurones identifiables. L’animal dispose d’un système circulatoire semi-ouvert, ce qui permet d’accéder à plusieurs de ses structures internes sans causer de dommages importants. Il est également robuste à de nombreuses manipulations à la fois in vivo et in vitro, ce qui en fait un modèle très traitable pour l’analyse du comportement et des circuits neuronaux.

Pour comprendre les modèles neuronaux qui donnent lieu à des comportements d’alimentation, il est important de décrire la mécanique sous-jacente de la structure molle qui constitue l’organe d’alimentation, la masse buccale⁴. Bien qu’il y ait eu des travaux pour caractériser les muscles externes qui composent la masse buccale⁵^,⁶, les muscles intérieurs de la structure sous-jacente dans la masse buccale qui contrôle la surface du grasper, l’odontophore, ont été largement inaccessible à l’expérimentation in vivo. Bien qu’il y ait eu des études in vitro sur les fonctions de certains de ces muscles⁷^,⁸, le manque d’accès direct à ces muscles a rendu difficile d’étudier leur rôle dans intact, le comportement des animaux.

La plupart des techniques d’implantation d’électrodes ou de lésions chez aplysia ou d’espèces mollusques similaires exigent que la paroi du corps soit ouverte⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². L’ouverture de la paroi du corps provoque des blessures épithéliales, et l’incision doit être scellée solidement pour empêcher l’échappement hémolymphe. Des difficultés encore plus graves sont posées lors de la tentative d’atteindre les muscles internes du grasper d’Aplysia (muscles sous-jacents à la surface radulaire ou à l’intérieur de l’odontophore): étant entré par la cavité corporelle principale, il faut alors passer par certains partie de la paroi musculaire de la masse buccale pour accéder aux structures intérieures (figure 1A). Cette accumulation de blessures et de difficultés d’accès a rendu l’approche par des moyens conventionnels problématique parce que les animaux ne se remettent pas bien de ces chirurgies (des animaux avec des versions complètes, seulement 17% ont retrouvé toute capacité d’alimentation, N -12. Environ 85 % des animaux non-vivants ont retrouvé la capacité de se nourrir, N ’84).

Le muscle I7, qui a été caractérisé comme un ouvreur radulaire⁸, est profondément à l’intérieur de l’odontophore lui-même, ce qui complique encore l’accès. Il s’étend entre la base de la tige radulaire (Figure 1C) et le dessous de la surface radulaire, à travers un lumen dans l’odontophore (Figure 1C). Sur trois côtés des muscles I7 sont des murs de muscle, et le quatrième mur se compose de la tige radulaire. Aux fins d’une étude biomécanique, une déficience majeure de l’une ou l’autre de ces structures compromettrait la fonction normale de l’appareil d’alimentation. Nous avons développé une nouvelle approche de travailler l’odontophore à travers les mâchoires, et la conduite de la chirurgie par une incision à la mince, cartilaginous surface radulaire, qui a permis de lésion du muscle I7, ainsi que les fibres musculaires fines nouvellement décrites qui courir juste sous la surface radulaire, que nous appelons les fibres sous-radulaires (Figure 1C).

Figure 1 : Aperçu anatomique. (A) Emplacement de la masse buccale dans Aplysia. (B) Anatomie externe de l’odontophore. La surface de la radule et du sac radulaire sont jaunes; les muscles composant l’odontophore sont représentés en rouge, en fonction de leurs couleurs réelles. (C) Section sagittale de l’odontophore, montrant l’emplacement des fibres sub-radulaires (ligne rose courbée) et du muscle I7 (ligne rose droite). La section transversale du muscle I6 est représentée en rouge foncé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocol

Les aplysias sont des invertébrés et ne sont donc pas soumis à l’approbation de l’UAIC. Pour minimiser l’inconfort chez les animaux, assurez-vous qu’ils sont entièrement anesthésiés avant d’appliquer les techniques chirurgicales décrites ci-dessous. 1. Sélection des animaux et anesthésie Sélectionnez un animal actif en lui offrant des algues et en confirmant que les intervalles de morsure ne sont pas supérieurs à entre 3 et 5 s. Anesthésiez l’animal avec 0,333 chlorure de magnésium molaire (voir tableau 1) en injectant près de la tête une aiguille de 18 G sur une seringue de 60 ml de sorte que la plus forte concentration d’anesthésique sera autour de la masse buccale. Prenez soin de pénétrer à la fois l’épithélium externe et la couche de tissu interne avec l’aiguille. Assurez-vous que l’injection est à peu près sous le rhinophore, à mi-chemin entre le rhinophore et le pied, et l’aiguille doit entrer obliquement, pointant dans la direction des mâchoires. Après 10 min, essayez doucement d’insérer une goupille dans la branchie et le rhinophore, en vérifiant que ceux-ci ne se rétractent pas, pour assurer une anesthésie suffisante. Assurez-vous que les lèvres et la mâchoire de la limace sont détendues afin que l’odontophore puisse être exposé.REMARQUE: Les rides sur les lèvres de la figure 2A indiquent que les lèvres et la mâchoire de l’animal ne sont pas suffisamment détendues pour que l’intervention chirurgicale soit effectuée sans dommage. Les lèvres lisses et détendues de la figure 2B indiquent que les mâchoires sont complètement détendues. Figure 2 : Tension et relaxation dans les bouches d’aplysia anesthésiées. (A) Aplysia montrant un degré élevé de tension musculaire autour des lèvres. Ceci est corrélé avec la tension de mâchoire et contre-indicates la procédure avec la chirurgie. (B) Aplysia aux lèvres détendues, montrant l’intérieur des mâchoires (gris clair). Les couleurs correspondent à nouveau à celles observées chez l’animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Si les lèvres d’un animal ne sont pas détendues, injectez 30 ml de chlorure de magnésium et attendez encore 5 min. Si cela n’entraîne pas de relaxation des lèvres, retournez-les dans un contenant isolé avec un bon débit d’eau pour leur permettre de récupérer (voir l’étape 4) et de procéder avec un autre animal. 2. Exposer la surface radulaire Placez la limace de sorte que la tête pend vers le bas, permettant à la masse buccale de s’installer contre les mâchoires. Appliquer la pression avec le pouce et l’index pour pousser la masse buccale vers les mâchoires, en maintenant la masse buccale en place. Faites pivoter les mâchoires pour qu’elles soient visibles. En même temps, maintenez la pression sur la masse buccale de sorte que la prow de la masse buccale soit visible à travers les mâchoires. (Figure 3). Figure 3 : Soutenir la masse buccale contre l’intérieur des mâchoires. Les doigts soutiennent la masse buccale qui a été poussée contre le bord intérieur des mâchoires jusqu’à ce que l’extrémité de la proue peut être vu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Travaillez doucement les pointes des forceps émoussés dans la fente de l’odontophore et utilisez-les pour tirer parti de la surface radulaire à travers les mâchoires. Si les mâchoires ne sont pas suffisamment détendues, utilisez les forceps pour saisir doucement le bord de la fente pour aider ce processus.MISE EN GARDE: Cette pression risque de nuire davantage à l’animal. Une fois que la surface est exposée, travailler les mâchoires à l’écart de la partie antérieure de la surface radulaire tout autour du périmètre. Cela rend l’odontophore moins susceptible de se rétracter (Figure 4). Assurez-vous que pas plus de la moitié des murs de l’odontophore est exposé. Figure 4 : Eversion partielle de l’Odontophore. La surface radulaire est entièrement exposée, mais les côtés de l’odontophore ne sont pas découverts, ce qui en fait seulement une éversion partielle. Une nouvelle éversion entraînera probablement des dommages à l’animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. REMARQUE: Une éversion complète de l’odontophore causera des dommages musculaires importants dont les animaux sont très lents à récupérer. 3. Incisions chirurgicales Une fois que la surface radulaire est entièrement exposée, disposer la limace sous une portée de dissection pour la chirurgie. Alternativement, utilisez un large élastique et une troisième main pour stabiliser les mâchoires et la surface radulaire pour la chirurgie, en particulier lors de l’apprentissage. Ceci, cependant, ajoute le temps et les dommages accrus de tissu à la procédure, qui la rend moins idéale sur le long terme. Placez la surface radulaire de sorte que le côté de fissure fait face à l’enquêteur. Saisissez doucement la surface radulaire, près de la base radulaire, de sorte qu’un pli horizontal soit formé perpendiculairement au pli anatomique. Utilisez des ciseaux fins pour couper à travers ce pli, faire une incision le long du pli anatomique (Figure 5). Figure 5 : Emplacement de l’incision à la surface radulaire. (A) Surface radulaire, avec une incision. (B) Surface radulaire avec des cercles montrant où les brins du muscle bilatéral I7 se fixent; lignes pointillées montrent l’emplacement des muscles descendant sous la surface radulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Étendre cette incision initiale à 3-5 cm pour permettre l’accès à l’intérieur de la masse buccale. Ajustez la lumière de sorte qu’elle pointe directement vers l’arrière à travers cette incision. Partie des bords de l’incision de sorte que le dos du lumen de l’odontophore et les brins verticaux minces du muscle I7 sont visibles. (Figure 6) Figure 6 : Emplacement de l’I7 par l’incision de surface radulaire. En regardant à travers l’incision, les deux brins de I7 peuvent être vus entre les surfaces intérieures de I4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Atteindre par l’incision, saisir les deux brins de I7, et les tirer vers le haut par l’incision, où autant que le muscle peut être coupé comme il est pratique (Figure 7). Figure 7 : Tirer le muscle De l’I7 à travers l’incision. Le muscle I7 est très élastique et peut être tiré vers le haut par l’incision pour l’enlèvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. REMARQUE: Avec la pratique, il est généralement plus efficace de localiser I7 par sensation que par la vue. 4. Soins postopératoires Après que des lésions aient été exécutées, saisissez les tentacules antérieurs, et poussez vers le bas sur la surface radulaire pour retourner la limace à sa configuration originale. Placez les animaux post-chirurgicaux dans un environnement protégé avec un bon débit d’eau. L’oxygénation accrue accélère la récupération. Assurez-vous que les animaux sont alertes et réactifs le lendemain de la chirurgie. Si ce n’est pas le cas, on peut supposer qu’ils ne se rétabliront pas.REMARQUE: Les animaux commencent habituellement à se nourrir le premier ou le deuxième jour après la chirurgie. Même les animaux qui ont de la difficulté à mordre devraient se voir offrir des algues, car c’est notre observation anecdotique que le rétablissement d’un animal est amélioré par ses tentatives de manger. 5. Pour la lésion sous-radulaire de fibre Suivez les étapes de 1.1 à 3.5 Insérez la pointe d’une petite lame de scalpel droite (#11 ou similaire) par l’incision avec le bord pointu incliné vers le haut. Gratter délicatement les fines fibres musculaires de la face inférieure de la surface radulaire. (Figure 8). Figure 8 : Lésion des fibres subradaires. Le bord de la lame du scalpel est incliné vers le haut par l’incision à la face inférieure de la surface radulaire de sorte qu’il puisse gratter doucement loin les fibres sub-radulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Retour à l’étape 4.1.

Representative Results

Des travaux antérieurs avaient suggéré que le muscle I7 a contribué à l’ouverture du grasper8. Nos propres études anatomiques ont suggéré que les fibres sub-radulaires pourraient également contribuer à l’ouverture de grasper. Pour tester ces hypothèses, les animaux ont été induits pour générer des morsures avant et après avoir reçu une intervention chirurgicale. Les animaux de Sham ont été soumis à toutes les étapes chirurgicales, y compris l’incision dans la surface radulaire, mais aucun muscle interne n’a été enlevé. Les animaux soumis à une lésion I7 ont eu les deux muscles I7 enlevés. Les animaux soumis à une lésion sous-radulaire de fibre ont eu ‘25% des fibres sub-radulaires enlevées immédiatement sous l’incision. Les lésions de Sham n’ont eu aucun effet significatif sur la largeur de l’ouverture au sommet de mordre, alors que les lésions de fibres I7 et sub-radulaires ont réduit de manière significative la largeur de morsure (figure 9). Figure 9 : Résultats des lésions sur la largeur d’ouverture pendant le pic de mordant. Les données montrées sont les différences entre la largeur d’ouverture normalisée moyenne de la radule avant et après l’intervention chirurgicale pour 5 animaux dans chacun des 3 groupes (faux, lésion I7, ou lésion SRF), chaque animal servant de son propre contrôle. Des moyennes ont été prises de 5 morsures avant, et de 5 morsures après l’intervention chirurgicale pour déterminer la différence normalisée moyenne. La largeur d’ouverture était la distance entre le centre de la radule et le bord radulaire à la protraction maximale, normalisée par la distance entre la surface intérieure de la base radulaire et les bords côté gauche de la surface radulaire. Les différences sont indiquées comme les moyens plus ou moins l’écart type. Après avoir établi que les données de différence étaient normalement distribuées, la probabilité que la lésion n’ait pas eu d’effet a été déterminée (c.-à-d., l’hypothèse nulle a été testée que les effets des interventions chirurgicales seraient nuls, en moyenne) en appliquant un t-test à chaque groupe indépendant. Les données démontrent que la lésion de faux n’a eu aucun effet significatif, alors qu’une lésion des muscles d’I7 ou une lésion des fibres sub-radulaires a eu un effet significatif sur l’ouverture radulaire (p lt ; 0.031 pour le groupe de lésion d’I7, indiqué avec un seul astérisque , ou p ‘lt; 0.002 pour le groupe de lésions SRF, indiqué par un double astérisque). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Poids corporel Dose de chlorure de magnésium 200 g 1/2 poids corporel 200-350 g 1/3 poids corporel 350-450 g 1/4 de poids corporel Tableau 1 : Dosage de chlorure de magnésium par poids corporel.

Discussion

Les étapes les plus critiques dans le protocole sont la nécessité de s’assurer que l’animal est entièrement anesthésié, et que l’éversion de la masse buccale est juste assez pour accéder aux muscles sous-jacents. Il peut exiger une certaine pratique pour perfectionner ces étapes, mais une fois qu’ils sont maîtrisés, le rendement des chirurgies est susceptible d’être supérieur à 85% de toutes les expériences effectuées. La façon la plus importante de bien modifier et dépanner le protocole est de passer du temps à faire des dissections de la masse buccale afin que les emplacements des muscles internes sont complètement clairs pour l’enquêteur. Puisque l’incision suggérée par la surface radulaire cause inévitablement quelques dommages aux fibres sous-radulaires sous-jacentes, il peut être approprié de modifier l’endroit exact de l’incision pour éviter des régions spécifiques de ces fibres.

Une limitation de la technique chirurgicale est qu’elle peut avoir des effets non spécifiques sur les réponses d’alimentation, telles que la force de la protraction. Une façon de surmonter cette limitation est d’avoir des animaux servent de leurs propres contrôles. En outre, il est essentiel d’avoir un groupe de lésions simulées qui est soumis à l’ensemble du protocole chirurgical, sauf pour l’ablation du muscle spécifique (c.-à-d., I7 ou les SRF). En suivant ces suggestions, un chercheur réduira les effets de la variabilité entre les animaux et aura une mesure intrinsèque des effets non spécifiques de la chirurgie.

Les travaux antérieurs ont utilisé des approches à travers la paroi du corps à la lésion ou enregistrer soit à partir de nerfs¹³^,¹⁴, ou les muscles¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Dans notre laboratoire, nous avons observé de façon anecdotique que les incisions de la paroi du corps sont souvent accompagnées d’une perte significative d’hémolymphe et donc de volume corporel. Les animaux ont souvent besoin de plusieurs jours pour s’en remettre, et si la lésion de la paroi du corps n’est pas soigneusement suture, les animaux peuvent ne pas récupérer. En outre, l’examen post-mortem des animaux indique des cicatrices considérables autour de l’incision et une forte réponse immunitaire (observations anecdotiques). En revanche, les animaux ne montrent aucune perte d’hémolymphe ou de changement de volume corporel après la récupération du protocole décrit ici (basé sur des observations chez 96 animaux).

Les applications futures de la technique peuvent l’étendre à d’autres muscles dans l’appareil d’alimentation d’Aplysia, et à d’autres animaux. Nous nous sommes concentrés sur l’élimination du muscle I7 et des fibres sub-radulaires. Ces mêmes techniques chirurgicales générales permettent également l’accès à la plupart des autres muscles de l’odontophore. Certains d’entre eux, comme la partie interne du muscle I5, sont mieux accessibles par la surface radulaire. D’autres, comme les folioles intérieures de I4, peuvent être mieux accessibles par l’épithélium extérieur de l’odontophore. Nous avons fait des essais préliminaires où une incision sous la fente radulaire de l’odontophore partiellement everted a permis l’accès pour un crochet aiguisé à insérer qui pourrait ensuite être utilisé pour lésion un autre muscle dans l’odontophore, muscle I8⁸. Puisque le protocole chirurgical décrit ici n’ouvre pas la cavité principale de corps, aucune suture n’est exigée.

Le protocole que nous avons décrit peut être d’intérêt général pour d’autres chercheurs travaillant sur des structures de tissus mous qui seraient autrement difficiles à manipuler, par exemple, l’appareil alimentaire d’autres mollusques. Plus généralement, ce protocole pourrait suggérer d’autres nouvelles approches chirurgicales à l’analyse des structures molles telles que les langues, les troncs ou les tentacules¹⁸.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à souligner le travail acharné que Sherry Niggel, Sisi Lu et Joey Wu ont consacré à l’amélioration et à la validation de ces protocoles. Ce travail a été soutenu par NSF Grant IOS 1754869.

Materials

Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data

References

Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, . Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).

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Cite This Article

Kehl, C., Chiel, H. J. A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica. J. Vis. Exp. (150), e60030, doi:10.3791/60030 (2019).