Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

As interações proteína-proteína dinâmicas constituem as cascatas de sinalização molecular e as estruturas motile que são a base funcional da maioria de fisiologia celular¹. Esses processos são frequentemente representados como vias de sinalização lineares que alternam entre Estados estáveis com base em entradas simples, mas os dados experimentais e de modelagem mostram claramente que funcionam como redes integradas^{2,3, 4}. no caso das proteínas g, diferentes receptores geralmente têm a capacidade de ativar a mesma proteína g, e um único receptor também pode ativar mais de um tipo de proteína g^5,6. Para que o número relativamente pequeno de classes de proteína G Module especificamente uma vasta gama de funções celulares, como transmissão sináptica, regulação hormonal e migração celular, as células devem integrar e diferenciar esses sinais^{4 , 5}. evidências mostraram que esta especificidade do sinal, para as proteínas G, bem como outras, é derivada principalmente com base em interações proteína-proteína finamente ajustadas e sua dinâmica temporal^{1,3, 4. º , 5. º , 6} anos de ^{, 7}. porque as redes de sinalização são compostas de complexos proteicos dinâmicos com múltiplas entradas, saídas e loops de feedback, uma única perturbação tem a oportunidade de alterar o equilíbrio homeostático geral da fisiologia de uma célula^{4 ,7}. É agora amplamente acordado que a sinalização deve ser examinada a partir de uma perspectiva de rede, a fim de entender melhor como a integração de múltiplas entradas controla funções celulares discretas na saúde e na doença^{7,8, 9,10,11,12,13}. À luz disto, a imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI) foi desenvolvida para reunir dados quantitativos de média taxa de transferência de mudanças em redes dinâmicas de interação protéica.

QMI é um ensaio anticorpo-baseado em que o lisado da pilha é incubado com um painel de anticorpos da imunoprecipitação que são acoplados covalentemente aos grânulos magnéticos que contêm relações distintas de tinturas fluorescentes. Ter anticorpos específicos acoplados às classes magnéticas distintas do grânulo permite a coimunoprecipitação simultânea de proteínas alvo múltiplas do mesmo lysate. Depois da imunoprecipitação (IP), os grânulos magnéticos são incubados com um segundo, anticorpo da ponta de prova conjugado fluorophore (ou anticorpo biotinylated conjuntamente com o streptavidin conjugado fluorophore). As coassociações entre as proteínas reconhecidas por cada par de anticorpos de anticorpo-sonda IP, ou peixes (proteínas em complexos compartilhados detectados por epítopos de superfície expostos), são então detectadas por citometria de fluxo e podem ser comparadas quantitativamente entre diferentes condições da amostra¹⁴. As ilustrações na Figura 1 mostram as etapas envolvidas na execução de um ensaio QMI, incluindo um diagrama de grânulos magnéticos com complexos proteicos imunoprecipitados marcados por anticorpos fluorescentamente conjugados da sonda (Figura 1C).

A sensibilidade do QMI depende da concentração proteica do lisado em relação ao número de grânulos magnéticos utilizados para a imunoprecipitação, e alcançar uma resolução para detectar 10% de alterações de dobra requer apenas uma pequena quantidade de material de partida em comparação com outros métodos de co-IP^14,15. Por exemplo, a quantidade de material de partida usada em QMI é similar àquela exigida para um ensaio enzima-lig ImmunoSorbent do sanduíche (ELISA), mas as interações múltiplas são detectadas em um único ensaio de QMI. Os ensaios de QMI que usam 20 IPs e 20 alvos da ponta de prova foram executados usando 1-5 x 10⁵ pilhas de T preliminares isoladas de uma biópsia da pele de 4 milímetros, de preparações synaptosomal P2 de uma seção coronal de 3 milímetros do córtice pré-frontal do rato, ou 3 x 10⁶ cultivaram o rato preliminar neurônios corticais^14,16,17. Esta sensibilidade faz QMI útil para a análise das pilhas ou do tecido com disponibilidade limitada, tal como amostras clínicas.

QMI pode ser adaptado para toda a rede previamente definida da interação da proteína (contanto que os anticorpos estão disponíveis), e até agora foi desenvolvido para analisar o signalosome do receptor do antígeno da pilha de T (TCR) e um subconjunto das proteínas em sinapses glutamatérgico nos neurônios ¹⁷ anos de ^{, 18}. em estudos de sinalização de receptores de células T, o QMI foi usado pela primeira vez para identificar alterações induzidas por estimulação em peixes e, em seguida, para distinguir pacientes autoimunes de um grupo controle, detectar sinalização autoimune endógena e, finalmente, gerar uma hipótese envolvendo uma subrede associada à doença desequilibrada das interações¹⁴. Mais recentemente, o mesmo painel de QMI foi usado para determinar que a seleção do anti-thymocyte está determinada por diferenças quantitativas um pouco do que qualitativas na sinalização TCR-associada¹⁹da proteína. Nos neurônios, o QMI foi usado para descrever o rearranjo de entrada específica de uma rede de interação protéica para tipos distintos de sinais de entrada de uma forma que suporta modelos recém-emergentes de plasticidade sináptica¹⁷. Adicionalmente, este painel de QMI sináptica foi usado para identificar diferenças em sete modelos do rato do autismo, aglomerar os modelos em subgrupos baseados em suas bioassinaturas de PiSCES, e supor exatamente um deficit molecular compartilhado que fosse previamente não reconhecido em um dos modelos¹⁶. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a tela de outros subgrupos que possam responder a diferentes tratamentos medicamentoso, ou atribuir medicamentos a subgrupos responsivos específicos. O QMI tem potenciais aplicações em diagnósticos, subtipagem de pacientes e desenvolvimento de fármacos, além da ciência básica.

Para montar um painel de anticorpos QMI, os protocolos iniciais de triagem e seleção de anticorpos estão descritos na seção 1, abaixo. Uma vez identificados os painéis de anticorpos, os protocolos de conjugação dos anticorpos selecionados para os grânulos magnéticos para IP e para a biotinilação dos anticorpos de sonda selecionados estão descritos na seção 2. O protocolo para a execução do ensaio QMI em lisados celulares ou teciduais é descrito na seção 3. Finalmente, uma vez que um único experimento pode gerar ~ 5 x 10⁵ DataPoints individuais, instruções e códigos de computador para auxiliar no processamento de dados, análise e visualização são fornecidos na seção 4. Uma visão geral do fluxo de trabalho descrito nas seções 2-4 é mostrada na Figura 1.