Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

El análisis ultraestructural del microscopio electrónico de barrido (SEM) y la imagen intracelular complementan la microscopía de luz para el perfilado tridimensional de prokaryotes, plantas y animales. La alta resolución espacial de un SEM lo convierte en una de las técnicas más versátiles y potentes disponibles para el examen de las características microestructurales de las muestras a escala de nanómetro a micrómetro. Los especímenes desecados se resuelven en estructuras compositivas y topográficas con detalles intensos, lo que proporciona la base para el desarrollo de conclusiones válidas sobre las relaciones funcionales^{1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. Al interpretar imágenes SEM de especímenes biológicos, es un gran desafío distinguir entre las estructuras nativas y los artefactos que se crean durante el procesamiento. El SEM generalmente se opera a vacíos muy altos para evitar cualquier interferencia de moléculas de gas que afecte a los haces de electrones primarios, secundarios o retrodispersos emitidos por la muestra^10,11. Además, los materiales biológicos son susceptibles a daños por radiación debido a sus propiedades deficientes o no conductoras. Es esencial que los especímenes cargados en el SEM estén completamente secos y libres de contaminantes orgánicos para eliminar cualquier posible desgasificación en un entorno de alto vacío^10,11. Dado que los especímenes biológicos se componen principalmente de agua, se requieren técnicas preparativas adicionales para garantizar que las estructuras nativas se mantengan.

La resolución obtenida se basa en la optimización de métodos de preparación específicos para los tipos de muestras y parámetros instrumentales utilizados. Por lo tanto, es necesario evitar el uso de pasos de procesamiento generalizado para todos los tipos de tejido. Algunos especímenes biológicos requerirán un procesamiento menos estricto para preservar su estructura, mientras que podría ser necesario más tiempo y cuidado para los tipos delicados de muestras para evitar la introducción de artefactos de secado, como la contracción y el colapso. La preparación de muestras es un paso crítico en la toma de imágenes SEM; los resultados de los estudios morfométricos están notablemente influenciados por los procedimientos de preparación de muestras^12,13. Los pasos de preparación comunes para muchas muestras biológicas son la fijación, deshidratación y recubrimiento con un metal como oro, platino o paladio para convertir sus superficies en conductoras para el análisis SEM. La naturaleza y la combinación de pasos utilizados variarán dependiendo del tipo de tejido, y los objetivos específicos del estudio. La acumulación de carga, la sensibilidad al vacío y el daño del haz de electrones plantean problemas al procesar muestras biológicas delicadas y blandas, lo que requiere pasos de procesamiento adicionales para conservar la estructura nativa del objeto. El uso de métodos convencionales como la fijación de tetróxido de osmio, y la deshidratación causan contracción y el colapso de los tejidos delicados^14,15,16,17. El objetivo del estudio es establecer metodologías elegantes derivadas de la combinación de ideas de estudios anteriores con modificaciones para preparar e imaginar tejidos delicados blandos (por ejemplo, embriones de reptiles, cáscara de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos).

La selección de un método de fijación adecuado es el primer paso más importante para el análisis microscópico de muestras biológicas. La fijación de los tejidos inmediatamente después del aisleo de un organismo es esencial para evitar alteraciones en su morfología debido a la descomposición. Un fijador eficaz debe terminar los procesos celulares permeando las células rápidamente y manteniendo el efecto irreversiblemente para estabilizar la estructura de la muestra para soportar tanto los pasos de procesamiento subsiguientes como el examen bajo el SEM^{17 , 18}. Aunque se conocen varios métodos de fijación química y física, la fijación química se utiliza más comúnmente para especímenes biológicos para evitar cualquier cambio celular debido a la autolisis, putrefacción, y efectos de secado. Hay numerosas formulaciones químicas fijativas discutidas en la literatura^{17,19,20,21,22,23}, fijadores que funcionan por desnaturalización y coagulando macromoléculas biológicas, y las que se fijan mediante macromoléculas reticulantes covalentemente. Los alcoholes se utilizan como fijadores desnaturalizantes que preservan muy mal la ultraestructura y se utilizan principalmente para la microscopía de luz y no se recomiendan para el análisis microscópico electrónico. Los fijativos reticulantes como el formaldehído, el glutaraldehído y el tetróxido de osmio crean reticulación intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro de los tejidos, proporcionando una excelente preservación de las ultraestructuras^{11 ,24,25,26}. Las muestras biológicas son sensibles a la temperatura. Se recomienda que la temperatura al comienzo de la fijación sea de 4oC para reducir la movilidad lateral de las proteínas de membrana, ralentizar la difusión de moléculas intercelulares y ralentizar la velocidad de fijación¹¹. El tiempo necesario para la fijación de los tejidos depende en gran medida del tamaño de la muestra y de la velocidad a la que el fijador difunde y reacciona con los componentes de la muestra. Una fijación durante la noche en 4% paraformaldehído o 3% de glutaraldehído en PBS a 4oC es el método preferido para el análisis SEM de los especímenes utilizados en este estudio por sus propiedades penetrantes secuenciales, que permiten procesar muestras delicadas más pequeñas^{17 , 18 , 19 , 20 , 27}. Se elimina un paso posterior a la fijación con tetróxido de osmio no sólo debido a su naturaleza tóxica, sino que también se ha encontrado que no implementa ninguna ventaja adicional para mejorar la calidad de imagen de las muestras analizadas en este estudio.

Las muestras biológicas contienen fluidos que interfieren con el funcionamiento de la SEM; por lo tanto, las muestras deben secarse antes de insertarlas en la cámara de muestras SEM. Una vez asegurada la deshidratación, el disolvente debe retirarse del tejido sin crear artefactos en las muestras debido a la tensión/secado superficial. Tres métodos de secado diferentes se utilizaron comúnmente durante el procesamiento de tejidos para imágenes SEM: secado por aire, secado de punto crítico, y muestras de secado por congelación^28,29,30,31. Pocos estudios informan de los tres métodos de secado que producen resultados idénticos con muestras de tejido animal^28,29,30,31. Una práctica general utilizada para especímenes más pequeños es la deshidratación química por una serie de concentración ascendente de alcohol y hexametildisilazane (HMDS), pero los especímenes más grandes se secan utilizando un instrumento de secado de punto crítico (CPD)^32. Durante el proceso de secado, fuerzas considerables formadas en pequeñas cavidades que pasan a través de la muestra por una interfaz líquido/gas; esto puede incluso conducir a un colapso completo de las estructuras huecas³³. Cualquier deformación que se produzca debido al tratamiento podría confundirse como una característica estructural nativa de la muestra. Por lo tanto, se debe eliminar el fenómeno generalizado para el procesamiento y se debe estandarizar un proceso de secado único para cada tipo de tejido, especialmente cuando se analizan muestras de tejido delicadas.

En varios ensayos realizados utilizando varias combinaciones de todos los procesos mencionados, estandarizamos los métodos que se pueden utilizar para el análisis SEM de tres tejidos delicados: embriones de reptiles, cáscaras de huevo de tortugas pintadas y cultivos de hongos. Los biólogos y morfologíadels del desarrollo describen la morfogénesis normal y anormal durante el desarrollo embrionario en animales vertebrados representativos. Las investigaciones sobre las vías de señalización génica dependen de la descripción morfológica de las estructuras novedosas. Para evitar cualquier cambio abrupto en la estructura del embrión vertebrado durante el análisis sem, recomendamos el secado químico después de la deshidratación. El secado químico con HMDS es el método de secado relativamente más reciente y las ventajas incluyenrapidez relativa, facilidad de uso, pérdida de costos y la limitada experiencia y equipo necesarios 9. La CPD es una técnica de secado comúnmente utilizada utilizando CO₂ de paso a través de las muestras a una temperatura y presión específicas. Identificamos que HMDS es adecuado para secar tejidos blandos delicados y permite procesar muestras más grandes en comparación con el secado de puntocrítico, lo que causó una deformación extensa a los tejidos embrionarios. Se han utilizado varios métodos para preparar muestras para imágenes SEM para estudiar las características morfológicas de los hongos^34. Los especímenes fúngicos se fijan comúnmente en tetróxido de osmio seguido de deshidratación de etanol y secado de puntocrítico, lo que puede proporcionar resultados satisfactorios, aunque los efectos tóxicos del tetróxido de osmio^6,7,35 y la pérdida de materiales fúngicos mientras se cambian las soluciones durante el procesamiento son desventajas pronunciadas. La técnica de preparación de muestras utilizando secado al aire sin fijación también se ha practicado^36, pero resulta en estructuras encogidas y colapsadas, y la observación de tales especímenes puede ser fácilmente malinterpretada mientras se caracteriza la especie. La hifa fúngica pierde su integridad en contacto con líquidos y es posible que no se logre un secado uniforme para restaurar la estructura. Debido a este efecto, secar por congelación se utiliza comúnmente para secar tejidos blandos como el micelio fúngico. El secado por congelación funciona bien para materiales limpios, pero la presencia de cualquier sales o secreción oscurecerá los detalles de la superficie que se identificarán solo en la etapa de visualización del SEM. Acoplamos el método de cultivo de diapositivas con la fijación de glutaraldehído y el secado de punto crítico para producir detalles estructurales de hifas y esporas fúngicas intactas. Aunque el secado por CPD causó contracción en embriones, resultó en estructuras miceliales bien conservadas cuando se combina con la fijación de glutaraldehído. La cáscara de huevo es de importancia primordial para el embrión de animales ovíparos, no sólo actuando como una cubierta protectora, sino también proporcionando estabilidad mecánica, permeabilidad al gas y al agua, y una reserva de calcio para el embrión en desarrollo. Las cáscaras de huevo de tortuga de agua dulce se clasifican como “rígidas” en función de su estructura, y debido a su disponibilidad han recibido una atención significativa de los biólogos^{1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38}.

Detallamos métodos simples para un fácil examen de las membranas de cáscara de huevo y concha de tortuga pintada que se pueden aplicar a cualquier especie rígida de cáscara de huevo. Las metodologías de preparación se evaluaron en función de la calidad de imagen resultante y la reducción de los artefactos potenciales.