E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Metabolitlerin ticaretinde rol oynayan proteinler fizyolojik düzenlemenin temel bir düzeyini oluşturmaktadır, ancak bitki zarı taşıyıcılarının büyük çoğunluğu henüz işlevsel olarak karakterize edilmemiştir. Yeni taşıma proteinlerini karakterize etmek için çeşitli stratejiler uygulanmıştır. E. coli gibi model organizmalarda heterolog ekspresyon ve maya, Kenopus oositleri, memeli hücreleri, böcek hücreleri ve bitki hücreleri gibi ökaryotik hücreler taşıma aktivitelerini belirlemek için kullanılmıştır^1. Ökaryotik hücreler ökaryotik proteinlerin ekspresyonu için tercih edilir, çünkü temel hücresel bileşim, sinyal transducing yolları, transkripsiyon ve çeviri makineleri yerli koşullarla uyumludur.

Maya bitkilerde yeni taşıma proteinleri karakterizasyonu için önemli bir model organizma olmuştur. Başarıyla maya ifade edildi ilk bitki taşıma proteini(Saccharomyces pombe) Chlorella²heksoz taşıyıcı HUP1 oldu. O zamandan beri, birçok bitki taşıma proteinleri fonksiyonel bir maya ifade sistemi kullanılarak karakterize edilmiştir. Bunlar, bitki şekeri taşıyıcıları (SUC1 ve SUC2³, VfSUT1 ve VfSTP1⁴⁾ve auxin taşıyıcılar (AUX1 ve PIN⁵⁾içerir. Bitki proteinlerini ifade etmek için maya kullanmanın dezavantajları, mayanın bu organelden yoksun olması, yanlış hedeflenme⁶, yanlış katlanmış agregaların oluşumu ve membran proteinlerinin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak mayadaki stres tepkilerinin aktivasyonu^7,8,9.

Xenopus oositlerinde taşıma proteinlerinin heterolog ekspresyonu¹⁰taşıyıcıların elektrofizyolojik karakterizasyonu nda yaygın olarak kullanılmaktadır. Xenopus oositlerinde heterolog ekspresyon kullanılarak karakterize edilen ilk bitki taşıma proteinleri Arabidopsis potasyum kanalı KAT1¹⁰ ve Arabidopsis heksoz taşıyıcısı STP1¹¹idi. O zamandan beri, Xenopus oositler plazma membran taşıyıcıları 12 gibi birçok bitki taşıma proteinleri karakterize etmek için istihdam edilmiştir^12,vacuolar sakaroz taşıyıcı SUT4¹³ ve vacuolar malate taşıyıcı ALMT9¹⁴. Xenopus oositlerinin taşıma tahlilleri için önemli bir sınırlama hücre içi metabolitlerin konsantrasyonunun manipüle edilemeyeceğidir^1. Ayrıca, profesyonel bilgi Xenopus oositler hazırlamak için gereklidir ve oosit toplu değişkenlik kontrol etmek zordur.

E. coli modelinde heterolog ifade, yeni bitki taşıma proteinlerinin karakterizasyonu açısından ideal bir sistemdir. Tam sekanslı genom¹⁵ile E. coli’nin moleküler ve fizyolojik özellikleri iyi bilinmektedir. Moleküler araçlar ve teknikler iyi¹⁶kurulmuştur. Buna ek olarak, farklı ekspresyon vektörleri, patojenik olmayan suşlar ve mutantlar mevcuttur^17,18,19. Ayrıca, E. coli yüksek bir büyüme hızına sahiptir ve laboratuvar koşullarında kolayca yetiştirilebilir. Birçok protein kolayca ifade edilebilir ve E. coliyüksek miktarlarda saflaştırılmış⁹. Proteinler hücresel sistemlerde doğrudan titreşemediğinde, proteinlerin lipozomlara dönüştürülmesi de başarılı olmuştur, ancak saflaştırılmış membran proteinlerinin karakterizasyonu için zorlu bir yenilik olmuştur. Soya fasulyesi, mısır, pirinç ve Arabidopsis, Arabidosil-trikarboksilit taşıyıcı gibi soya, mısır, pirinç ve Arabidopsis, dikarboksilat-trikarboksilat taşıyıcı gibi solute taşıyıcılar da dahil olmak üzere bitki mitokondriyal taşıma proteinleri fonksiyonel karakterizasyonu bu model sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir^20,21. Ancak, domates proteini SICAT9 rekombinant proteinlerreconstitution deneylerde fonksiyonel olmayan bulundu, ve CAT taşıyıcı ailesinin diğer üyeleri Xenopus oosit tahlilleri fonksiyonel olmayan bulundu²². Bu nedenle membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için ek moleküler araçlara ihtiyaç vardır.

E. coli^23’tebeş poliamin taşıma sistemi bulunur. Bunlar spermidin ve putrescine alımı aracılık iki ABC taşıyıcılar, bir putrescine / ornitin eşanjör, bir kadavra / lizin değiştirici, bir spermidin ihracatçısı ve putrescine ithalatçısı içerir. Putrescine değiştirici PotE başlangıçta bir vezikül titreği kullanılarak karakterize edildi, iç dış veziküller bir Fransız basın ıskarta hücreleri lysing tarafından hazırlanan ve ornithine karşılığında veziküller içine radiolabeled putrescine alımını ölçme²⁴. Vezikül tahlilleri de bir proton gradyan²⁵yanıt olarak kalsiyum taşıma aracılık bir kalsiyum taşıyıcı karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu deneyler bizi diğer poliamin eşanjörleri karakterizasyonu için bir strateji geliştirmek için istenir. Biz ilk PotE ve CadB değiştiriciler E. coli eksik bir gerginlik oluşturdu. Burada, modifiye E. coli suşunda heterlogous ifade ile bir bitki poliamin antiporter fonksiyonel karakterizasyonu göstermek, bir Fransız basın kullanarak membran vezikülüretimi, ve radiolabeled tahliller.