Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários
Summary
Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.
Abstract
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser um grande problema de saúde, apesar da introdução da terapia antirretroviral combinada (cART) em meados da década de 1990. Embora a terapia antirretroviral reduza eficientemente a carga viral sistêmica e restaure a contagem normal de células T CD4+ T, ela não reconstitui um sistema imunológico completamente funcional. Um sistema imunológico disfuncional em indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART pode ser caracterizado por ativação imunológica, envelhecimento precoce de células imunes ou inflamação persistente. Essas condições, juntamente com fatores comórbidos associados à infecção pelo HIV, adicionam complexidade à doença, que não pode ser facilmente reproduzida em modelos celulares e animais. Para investigar os eventos moleculares subjacentes à disfunção imunológica nesses pacientes, um sistema para cultura e manipular monócitos primários humanos in vitro é apresentado aqui. Especificamente, o protocolo permite a cultura e transfecção do CD14 primário+ monócitos obtidos a partir de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART, bem como de controles HIV-negativos. O método envolve isolamento, cultura e transfecção de monócitos e macrófagos derivados de monócitos. Embora kits e reagentes comercialmente disponíveis estejam empregados, o protocolo fornece dicas importantes e condições otimizadas para aadesão bem-sucedida e transfecção de monócitos com miRNA imitadores e inibidores, bem como com siRNAs.
Introduction
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) causa disfunção imunológica grave, o que pode levar a infecções oportunistas e à síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Embora os pacientes infectados pelo HIV submetidos a CART sejam caracterizados por baixas cargas virais e contagens normais de células T CD4+ T, o funcionamento do sistema imunológico pode ser comprometido nesses indivíduos, levando a uma resposta imune disfuncional que tem sido associada a um risco aumentado de desenvolver câncer1. Os mecanismos de disfunção imunológica em pacientes com HIV em cART permanecem em grande parte desconhecidos. Portanto, caracterizar as células imunes derivadas do paciente e investigar sua biologia e função é um componente crítico da pesquisa atual sobre HIV.
Monócitos e macrófagos são reguladores-chave das respostas imunes e desempenham papéis fundamentais na infecção pelo HIV2,3,4,5. Heterogêneo e plástico na natureza, macrófagos podem ser amplamente classificados em ativado classicamente (M1) ou ativado alternativamente (M2). Embora essa classificação geral seja necessária na criação de condições experimentais, o status de polarização dos macrófagos pode ser revertido por uma variedade de citocinas6,7,8,9. Embora vários estudos tenham investigado os efeitos da infecção pelo HIV em monócitos e células dendríticas, detalhes moleculares de respostas mediadas por monócito são em grande parte desconhecidos6,7,10,12,12,14,15,16,17,18,19. Entre os fatores envolvidos na regulação e função das células imunes, microRNAs (miRNAs), RNAs curtos não codificadores que regulam a expressão gênica pós-transcritoria, têm demonstrado desempenhar um papel importante no contexto das principais vias celulares (ou seja, crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose)20. Estas moléculas têm sido descritas como importantes reguladores de fatores de transcrição essenciais para ditar a polarização funcional dos macrófagos21. O papel potencial dos miRNAs em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART tem sido investigado, mas o progresso no campo requer muito mais trabalho22,23,24,25,26. Este artigo discute um método otimizado para transfect miRNAs e siRNAs em monócitos humanos primários de pacientes infectados pelo HIV e controles.
Este protocolo baseia-se em reagentes e kits comercialmente disponíveis, uma vez que a continuidade no procedimento técnico ajuda a eliminar variáveis experimentais desnecessárias ao trabalhar com amostras clínicas. No entanto, o método fornece dicas importantes (ou seja, o número de células banhadas ou breve incubação com mídia livre de soro para promover a adesão das células à placa). Além disso, as condições de polarização utilizadas neste protocolo são derivadas do trabalho publicado27,28,29.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado demonstra o uso de células primárias de indivíduos infectados pelo HIV como modelo para o estudo de monócitos e macrófagos. HIV+ pacientes submetidos a cART vivem com infecção por vários anos e também podem ter outras co-infecções relacionadas a um sistema imunológico comprometido. Para estudar a imunomodulação na presença de infecção crônica do HIV, as células foram colhidas diretamente dos pacientes. Como miRNAs têm demonstrado desempenhar papéis importantes no de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Núcleo biorepositório clínico/tumoral do HIV por fornecer amostras de pacientes e o Núcleo de Metabolismo de Imunologia Celular por fornecer análise de citometria de fluxo. Este projeto foi financiado pelo NIH P20GM121288e e P30GM114732.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 366643 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | Flow cytometry |
| CD14 PerCP | Invitrogen | 46-0149-42 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD163 BV711 | BD Horizon | 563889 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD209 BV421 | BD Horizon | 564127 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD80 FITC | BD Horizon | 557226 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| CD83 APC | BD Horizon | 551073 | Flow cytometry- conjugated antibody |
| Easy 50 EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit | StemCell Technologies | 19669 | |
| EIF4EBP1 mAb | Cell Signaling | 9644 | Monoclonal antibody for Western blot |
| EIF4EBP1 siRNA | Santa Cruz | sc-29594 | |
| Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated | Hyclone | SH30070.03HI | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter | B43618 | |
| GAPDH mAb | Santa Cruz | SC-47724 | Monoclonal antibody for Western blot |
| HuFcR Binding Inhibitor | eBiosciences | 14-9161-73 | Flow cytometry- blocking buffer |
| Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | B16406 | Software to analyze flow cytometry data |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 | Sigma | L4524 | |
| miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p | Qiagen | YM00472124 | |
| MISSION miRNA Negative Control | Sigma | HMC0002 | Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye |
| Nunc 35mm Cell Culture Dish | Thermo Scientific | 150318 | |
| PBS | Gibco | 20012027 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Human GM-CSF | R&D Systems | 215-GM-050 | |
| Recombinant Human IFN-γ | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-4 | R&D Systems | 204-IL-010 | |
| Recombinant Human M-CSF | R&D Systems | 216-MC-025 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Corning | 10040CVMP | |
| Scrambled Control siRNA | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Viromer Blue Transfection Reagent Kit | Lipocalyx | VB-01LB-01 | |
| WST-1 Cell Proliferation Reagent | Roche | 5015944001 | Colorimetric assay to assess cell viability |
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