一种基于强健聚合酶链反应的测定法，用于定量易碎 X 智力迟钝-1 基因中的细胞氨酸-鸟-鸟-鸟- 三核苷酸重复

易碎 X 综合征 （FXS） 和易碎 X 相关疾病，例如震颤和失流综合征 （FX-TAS），以及原发性卵巢功能不全 （FX-POI） 主要是由 5′ 未翻译的细胞氨酸-瓜氨酸 -瓜氨酸 （CGG） 三核苷酸重复扩张引起的Xq27.3^1，2. 脆弱 X 智力迟钝 -1（FMR1）基因的区域 （UTR）FMR1编码蛋白（FMRP）是一种多核体相关的RNA结合蛋白，通过调节mRNA的替代拼接、稳定性和树突状传输或调制合成，在神经元发育和突触可塑性方面发挥作用部分贴午后蛋白3，4，5，6，7。

CGG重复大小为>200的动态变异被描述为完全突变，导致FMR1启动^子8的异常超甲基化和随后转录沉默。由此产生的FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，并导致FXS^9，其特征是各种临床症状，包括中度至重度智力残疾、发育迟缓、过度活跃行为、不良接触和孤独症表现10，11，12。女性FXS患者的表达通常比男性温和。CGG 重复大小从 55 到 200 和 45 到 54 分别归类为预突变和中间状态。由于高度不稳定，CGG重复大小在预突变或中间等位基因大概扩大时，从父母传给^{后代13，14。}因此，具有预突变等位基因的携带者由于重复扩张而使儿童受FXS影响的风险很高，在某些情况下，中间等位基因可以将其重复大小扩展到两^代15之间的全部突变^{范围。 16}.此外，预变异的男性也增加患晚发病FX-TAS^17、18、19的风险，而预突变女性则倾向于FX-TAS和FX-POI^{20， 21，22}.最近，有报道称，患有发育迟缓和社会行为问题的自闭症谱系障碍在预突变FMR1等位^{基因23、24}的儿童中出现。

确定确切的CGG重复大小对于FXS和易碎X相关疾病的分类和预测^{具有重要意义25，26。}从历史上看，CGG重复区域特异性聚合酶链反应（PCR）具有片段大小加上南方斑点分析，是FMR1 CGG^重复27分子分析的黄金标准。然而，传统的特异性PCR对超过100至130次重复的大型预突变不太敏感，并且无法扩增完全^{突变27，28。}此外，用于重复尺寸的传统基因分析仪上的毛细血管电泳无法检测超过 200 CGG 重复的FMR1 PCR 产品。南方印斑分析能够区分更广泛的重复大小，从正常突变到完全突变重复数，并已广泛用于确认完全突变（在男性）和区分异质异位基因与完全突变明显具有正常重复大小的同源性等位子（在女性中）。但是，量化重复的分辨率是有限的。更重要的是，这种分步测试策略是劳动密集型、耗时且成本效益高的。

在这里，我们提出了一种准确和可靠的基于PCR的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动器的 5’UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增。PCR 产品经过纯化，片段大小在微流体毛细管电泳仪器上执行，随后使用分析软件对 CGG 重复次数进行解释，通过引用基于PCR 片段长度与 CGG 重复次数成正比。PCR系统包括促进高GC富分子三核苷酸重复区域扩增的试剂。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的所有CGG重复范围。这是一种经济高效的方法，可在FXS和易碎X相关疾病的分子诊断和筛查中得到广泛应用，周转时间少，设备投资更少，因此可用于更广泛的临床实验室。