シトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを脆弱なX精神遅滞-1遺伝子で繰り返す堅牢なポリメラーゼ連鎖反応性アッセイ

脆弱X症候群(FXS)および脆弱X関連疾患、例えば、振戦および運動失調症候群(FX-TAS)、および原発性卵巣不全(FX-POI)は、主にシトシン・グアニン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返し拡張によって引き起こされる5’Xq27.3^1,2の脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子の領域(UTR)。FMR1エンコードタンパク質(FMRP)は、mRNAの代替スプライシング、安定性、樹状輸送を調節または合成を調節することにより、神経発達およびシナプス可塑性に機能するポリリボソーム関連RNA結合タンパク質である。部分的な後転来タンパク質^{の3、4、5、6、7}.

>200のCGG繰り返しサイズを有する動的変動は、FMR1^{プロモーター8}の異常な過メチル化およびその後の転写サイレンシングを誘発する完全な突然変異として記述される。FMRPタンパク質の欠如または欠乏は、正常な神経発達を破壊し、FXS⁹を引き起こし、中等度から重度の知的障害、発達遅延、過活動行動を含む様々な臨床症状によって特徴付け、貧しい接触と自閉症の症状^10,11,12.女性FXS患者のプレゼンテーションは、一般的に男性のそれよりも穏やかです.55 から 200、45 から 54 までの CGG 繰り返しサイズは、それぞれ前変異および中間ステータスとして分類されます。不安定度が高いため、CGGは、親から^{子孫13、14}に伝染すると、おそらく変異または中間対立遺伝子のサイズを繰り返す。したがって、変異アレエレを有するキャリアは、繰り返し拡大のためにFXSの影響を受ける子供を持つ危険性が高く、場合によっては、中間ア列は、2^世代15の完全な突然変異範囲にその繰り返しサイズを拡大することができます。 ¹⁶.さらに、変異を有する男性はまた、遅発性FX-TAS^17、18、19を発症するリスクの増加を伝え、一方、変異女性はFX-TASとFX-POI²⁰の両方に対して素因がある。 ^21、22。近年、発達遅延や社会行動の問題を伴う自閉症スペクトラム障害が、FMR1アエレ^{メント23,24}の変異を有する小児において提示されていると報告されている。

正確なCGG繰り返しサイズを決定することは、FXSおよび脆弱X関連^障害25,26の分類および予測に大きな意義がある。歴史的に、フラグメントサイジングとサザンブロット解析を伴うCGGリピート領域特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、FMR1 CGGリ^ピート27の分子プロファイリングのゴールドスタンダードとなっています。しかし、従来の特定のPCRは、100から130以上の繰り返しを有する大きな変異に対して感受性が低く、完全な突然^{変異27、28}を増幅することができない。さらに、繰り返しサイジングのための従来の遺伝子アナライザ上の毛細管電気泳動は、200以上のCGG繰り返しを持つFMR1 PCR製品を検出するのに失敗します。サザンブロット解析は、正常から完全な突然変異繰り返し数まで、より広い範囲の繰り返しサイズの区別を可能にし、(男性で)完全な突然変異を確認し、完全な突然変異を持つヘテロ接合性アエレを区別するために広く使用されてきました。明らかに通常の繰り返しサイズを持つホモ接合性のアエレ(雌)。ただし、繰り返しを定量化する解像度は限られています。さらに重要なのは、この段階的なテスト戦略は、労働集約的で時間がかかり、コストがかからないことにあることです。

ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なPCRベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱X PCRキットを使用してFMR1プロモーターの5’UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅です。PCR製品は精製され、断片サイジングはマイクロ流体毛細血管電気泳動器具上で行われ、その後のCGG反復回数の解釈は、既知の繰り返しに基づく基準を参照して分析ソフトウェアを使用して行う。PCR フラグメントの長さは、CGG の繰り返し回数に直接比例するという根拠。PCRシステムには、高度にGCリッチなトリヌクレオチド反復領域の増幅を促進する試薬が含まれる。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、FMR1プロモーターのCGG繰り返しのすべての範囲を識別することができる。これは、FXSおよび脆弱X関連障害の分子診断およびスクリーニングに幅広い応用を見出すことができる費用対効果の高い方法であり、機器への投資の時間と投資を少なくし、より広い範囲の臨床で利用することができる研究 所。