Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

Fragiele X syndroom (FXS) en fragiele X geassocieerde aandoeningen, bijvoorbeeld tremor en ataxie syndroom (FX-TAS), en primaire ovariële insufficiëntie (FX-POI) worden voornamelijk veroorzaakt door Cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide herhalings uitbreiding in de 5 ‘ onvertaalde regio (UTR) van het fragiele X Mental Retardation^{-1 (}FMR1) gen op xq 27,3^1,2. De FMR1 gecodeerd eiwit (FMRP) is een poly ribosome-geassocieerde RNA-bindende proteïne dat functioneert in neuronale ontwikkeling en synaptische plasticiteit door het reguleren van alternatieve splicing, stabiliteit, en dendritische transport van mRNA of modulerende synthese van partiële postsynaptische eiwitten^3,4,5,6,7.

De dynamische variatie met een CGG herhalings grootte van > 200 wordt beschreven als volledige mutatie, die de afwijkende hypermethylatie en daaropvolgende transcriptionele uitschakeling van de FMR1 Promoter⁸induceert. De resulterende afwezigheid of het ontbreken van het FMRP-eiwit verstoort de normale neuronale ontwikkeling en veroorzaakt FXS⁹, gekenmerkt door verschillende klinische symptomen, waaronder matige tot ernstige verstandelijke handicap, ontwikkelingsachterstand, hyperactieve gedragingen, slechte contacten en autistische manifestaties^10,11,12. De presentatie bij vrouwelijke FXS-patiënten is over het algemeen mildere dan die bij mannen. De CGG herhalings grootte variërend van 55 tot 200 en 45 tot 54 zijn geclassificeerd als premutatie en tussenliggende status, respectievelijk. Vanwege de hoge mate van instabiliteit, breidt de CGG-herhalings grootte in een premutatie of intermediair allel vermoedelijk uit wanneer ze worden overgebracht van ouders naar nakomelingen^13,14. Zo zijn dragers met premutatie allelen met een hoog risico op het krijgen van kinderen getroffen met FXS vanwege de herhaalde expansie, en in sommige gevallen kunnen intermediaire allelen hun herhalings grootte uitbreiden tot het volledige mutatie bereik van twee generaties^{15, 16}. Bovendien geven mannetjes met premutatie ook een verhoogd risico op het ontwikkelen van Late-onset FX-tas^17,18,19, terwijl premutatie vrouwtjes voorbestemd zijn voor zowel FX-tas als FX-POI^{20, 21,22}. Onlangs is gemeld dat autistische spectrum stoornissen met vertraging in de ontwikkeling en problemen in sociaal gedrag worden gepresenteerd bij kinderen met premutatie FMR1 allelen^23,24.

Om te bepalen van de exacte CGG REPEAT grootte is van groot belang voor de classificatie en voorspelling van de FXS en fragiele X-geassocieerde aandoeningen^25,26. Historisch gezien is de CGG herhalings regiospecifieke polymerase kettingreactie (PCR) met fragment dimensionering plus Southern blot analyse de gouden standaard voor moleculaire profilering van de FMR1 CGG REPEAT²⁷. Traditionele specifieke PCR is echter minder gevoelig voor grote premutaties met meer dan 100 tot 130 herhalingen en is niet in staat om volledige mutaties te versterken^27,28. Bovendien kan capillaire elektroforese op een traditionele genetische analysator voor herhaalde dimensionering FMR1 PCR-producten niet detecteren met meer dan 200 CGG-herhalingen. De Southern blot-analyse maakt differentiatie mogelijk van een breder scala aan herhalings grootte, van normale tot volledige mutatie herhalings nummers, en is op grote schaal gebruikt voor het bevestigen van volledige mutaties (bij mannetjes) en het differentiëren van heterozygoot allelen met een volledige mutatie uit blijkbaar homozygoot allelen met normale herhaalde maten (bij vrouwtjes). De resolutie voor het kwantificeren van de herhalingen is echter beperkt. Nog belangrijker is dat deze stapsgewijze teststrategie arbeidsintensieve, tijdrovende en kosten ineffectief is.

Hier presenteren we een accurate en robuuste PCR-gebaseerde methode voor de kwantificering van de CGG herhalingen van FMR1. De eerste stap van deze test is de PCR-versterking van de herhalings sequenties in de 5 ‘ UTR van de FMR1 Promoter met behulp van de FRAGIELE X PCR Kit. De PCR-producten worden gezuiverd en fragment dimensionering wordt uitgevoerd op een microfluïdisch capillair elektroforese instrument, en de daaropvolgende interpretatie van het aantal CGG herhalingen met behulp van de analyse software door te verwijzen naar normen met bekende herhalingen op basis van de de reden dat de lengte van het PCR-fragment recht evenredig is aan het aantal CGG-herhalingen. Het PCR-systeem omvat reagentia die de versterking van het zeer GC-rijke trinucleotide herhalingsgebied vergemakkelijken. Deze PCR-gebaseerde test is reproduceerbaar en kan alle bereiken van CGG-herhalingen van FMR1 -promotors identificeren. Dit is een kosteneffectieve methode die een brede toepassing kan vinden in de moleculaire diagnostiek en screening van FXS en fragiele X-gerelateerde aandoeningen met minder turn-around tijd en investeringen in apparatuur en dus kan worden gebruikt in een breder spectrum van klinische Laboratoria.