تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث
Summary
في هذه المقالة، نقدم البروتوكول الذي يوصف بأنه تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM) القائم على الهدف الآفات المحلية المستحثة في الجينوم (TILLING). تستخدم هذه الطريقة تغيرات الفلورة أثناء ذوبان الحمض النووي المزدوج وهي مناسبة لفحص الإنتاجية العالية لكل من الإدراج/الحذف (Indel) وsubstition قاعدة واحدة (SBS).
Abstract
الآفات المحلية المستحثة الهدف في الجينوم (TILLING) هي استراتيجية لعلم الوراثة العكسي لفحص الإنتاجية العالية للطفرات المستحثة. ومع ذلك، فإن نظام TILLING لديه أقل قابلية للتطبيق للإدراج / الحذف (Indel) الكشف والتقليدية TILLING يحتاج خطوات أكثر تعقيدا، مثل CEL I nuclease الهضم والكهربائي هلام. ولتحسين كفاءة الإنتاجية والاختيار، ولجعل فحص كل من الركائز الأساسية والأساسية الفردية ممكناً، يتم تطوير نظام جديد للذوبان عالي الاستبانة قائم على نظام الحرث. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لـ HRM-TILLING ونظهر تطبيقه في فحص الطفرات. يمكن لهذه الطريقة تحليل طفرات أمبليكونPC PCR عن طريق قياس إزالة الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في درجات حرارة عالية. يتم إجراء تحليل إدارة الموارد البشرية مباشرة بعد PCR دون معالجة إضافية. وعلاوة على ذلك، يتم دمج طريقة بسيطة وآمنة وسريعة (SSF) استخراج الحمض النووي مع HRM-TILLING لتحديد كل من Indels وSBSs. إن بساطتها وقوتها والإنتاجية العالية تجعلها مفيدة للمسح الضوئي للطفرات في الأرز والمحاصيل الأخرى.
Introduction
المسوخ هي الموارد الوراثية الهامة لبحوث علم الجينوم وظيفية النباتية وتربية أصناف جديدة. وكان نهج علم الوراثة المتقدم (أي من اختيار المتحولين إلى استنساخ الجينات أو تطوير الأصناف) هو الأسلوب الرئيسي والوحيد لاستخدام الطفرات المستحثة قبل حوالي 20 عاماً. وقد فتح تطوير طريقة جديدة لعلم الوراثة العكسية، TILLING (استهداف الآفات المحلية المستحثة في الجينومات) من قبل McCallum وآخرون1 نموذجا جديدا، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقه في عدد كبير من الأنواع الحيوانية والنباتية2. الحرث مفيد بشكل خاص لسمات تربية التي هي صعبة من الناحية الفنية أو مكلفة لتحديد (على سبيل المثال، مقاومة الأمراض، والمحتوى المعدني).
تم تطوير الحرث في البداية لفحص الطفرات نقطة الناجمة عن الطفراتالكيميائية (على سبيل المثال، EMS 1،3). وهي تشمل الخطوات التالية: إنشاء مجموعة (مجموعات) من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء مجموعة من السكان؛ وإنشاء إعداد الحمض النووي وتجميع النباتات الفردية؛ تضخيم PCR لجزء الحمض النووي المستهدف؛ تشكيل heteroduplexes عن طريق denaturation والصلب من amplicons PCR والانقسام من قبل CEL I nuclease. وتحديد الأفراد المتحولين والآفات الجزيئية المحددة3،4. ومع ذلك، لا يزال هذا الأسلوب معقدة نسبياً، وتستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض الإنتاجية. لجعله أكثر كفاءة ومع زيادة الإنتاجية، تم تطوير العديد من طرق الحرث المعدلة،مثل حذف الحرث (De-TILLING) (الجدول 1)1،3،5،6، 7،8،9،10،11،12.
تحليل منحنى إدارة الموارد البشرية، الذي يقوم على التغيرات الفلورية أثناء ذوبان الحمض النووي المزدوج، هو طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وعالية الإنتاجية لفحص الطفرات والنمط الجيني13. وقد استخدمت إدارة الموارد البشرية بالفعل على نطاق واسع في البحوث النباتية بما في ذلك HRM القائم على الحرث (HRM-TILLING) لفحص الطفرات SBS الناجمة عن الطفرات EMS14. هنا، قدمنا بروتوكولات مفصلة لـ HRM-TILLING لفحص الطفرات (كل من Indel وSBS) التي تسببها أشعة غاما (γ) في الأرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت أن الحرث أداة وراثية عكسية قوية لتحديد الطفرات المستحثة للتحليل الوظيفي للجينات وتربية المحاصيل. بالنسبة لبعض الصفات التي لا يمكن ملاحظتها أو تحديدها بسهولة، يمكن أن يكون الحرث مع الكشف عن الطفرات المستندة إلى PCR عالية الإنتاجية طريقة مفيدة للحصول على المتحولين للجينات المختلفة….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2016YFD0102103) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31701394).
Materials
| 2× Taq plus PCR Master Mix | Tiangen, China | KT201 | PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification |
| 96-well plate | Bio-rad, America | MSP-9651 | Specific plate for PCR in HRM analysis |
| Mastercycler nexus | Eppendorf, German | 6333000073 | PCR amplification |
| LightScanner | Idaho Technology, USA | LCSN-ASY-0011 | For fluorescence sampling and processing |
| CALL-IT 2.0 | Idaho Technology, USA | For analysis of the fluorescence change | |
| EvaGreen | Biotium, USA | 31000-T | Fluorescence dye of HRM |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific, USA | ND2000 | For DNA quantification |
References
- McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
- Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
- Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
- Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
- Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
- Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
- Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
- Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
- Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
- Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
- Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
- Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , (1976).
- Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
- Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
- Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
- Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
- Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
- Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).
