Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Jason E Chung; Hannah  R Joo; Clay  N Smyth; Jiang Lan Fan; Charlotte Geaghan-Breiner; Hexin Liang; Daniel  Fan Liu; Demetris Roumis; Supin Chen; Kye  Y Lee; Jeanine  A Pebbles; Angela  C Tooker; Vanessa  M Tolosa; Loren  M Frank

doi:10.3791/59957

JoVE Journal > Neuroscience

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신경과학

Impianto cronico di più array di elettrodi polimerici flessibili

Published: October 04, 2019

doi:

10.3791/59957

Jason E Chung*^1,2, Hannah R Joo*^1,2, Clay N Smyth², Jiang Lan Fan³, Charlotte Geaghan-Breiner², Hexin Liang², Daniel Fan Liu³, Demetris Roumis², Supin Chen^4,5, Kye Y Lee⁴, Jeanine A Pebbles⁴, Angela C Tooker⁴, Vanessa M Tolosa^4,5, Loren M Frank^2,6

¹Medical Scientist Training Program and Neuroscience Graduate Program,University of California San Francisco, ²Kavli Institute for Fundamental Neuroscience, Center for Integrative Neuroscience, and Department of Physiology,University of California San Francisco, ³Bioengineering Graduate Program,University of California San Francisco, ⁴Center for Micro- and Nanotechnology,Lawrence Livermore National Laboratory, ⁵Neuralink Corp., ⁶Howard Hughes Medical Institute

Summary

Di seguito è descritto un metodo per l’impianto di più array di elettrodi polimerici attraverso regioni cerebrali anatomicamente distanti per la registrazione elettrofisiologica cronica in ratti liberamente in movimento. La preparazione e l’impianto chirurgico sono descritti in dettaglio, con particolare attenzione ai principi di progettazione per guidare l’adattamento di questi metodi per l’uso in altre specie.

Abstract

Le registrazioni simultanee da grandi popolazioni di singoli neuroni attraverso regioni cerebrali distribuite da mesi ad anni consentiranno nuove strade di sviluppo scientifico e clinico. L’uso di array di elettrodi polimerici flessibili può supportare la registrazione di lunga durata, ma le stesse proprietà meccaniche che consentono la longevità della registrazione rendono più inserimenti e integrazione in un impianto cronico una sfida. Ecco una metodologia con cui più array di elettrodi polimerici possono essere indirizzati a un insieme relativamente non vincolato di aree cerebrali.

Il metodo utilizza dispositivi polimerici a pellicola sottile, selezionati per la loro biocompatibilità e capacità di ottenere interfacce di registrazione elettrofisiologica a lungo termine e stabili. L’impianto risultante consente un targeting accurato e flessibile di regioni anatomicamente lontane, stabilità fisica per mesi e robustezza al rumore elettrico. La metodologia supporta fino a sedici dispositivi inseriti in serie su otto diversi obiettivi anatomici. Come dimostrato in precedenza, la metodologia è in grado di registrare da 1024 canali. Di questi, i 512 canali di questa dimostrazione utilizzati per la registrazione di singolo neurone hanno prodotto 375 unità singole distribuite in sei siti di registrazione. È importante sottolineare che questo metodo può anche registrare singole unità per almeno 160 giorni.

Questa strategia di impianto, tra cui rinforzare temporaneamente ogni dispositivo con una navetta retrattile di inserimento in silicio, comporta il tethering dei dispositivi alle loro profondità di destinazione ad un pezzo di base in plastica aderente al cranio che è progettato su misura per ogni set di registrazione stabilizzazione/protezione dei dispositivi all’interno di una custodia in plastica con dimensioni di silicone e su misura. È inoltre trattata la preparazione di dispositivi per l’impianto e principi di progettazione che dovrebbero guidare l’adattamento a diverse combinazioni di aree cerebrali o progetti di array.

Introduction

Un impianto neurale ideale registrerebbe da un gran numero di singoli neuroni in aree distribuite del cervello per settimane a mesi. Gli array di elettrodi polimerici flessibili forniscono registrazioni elettrofisiologiche con la longevità di registrare per mesi e la stabilità per tracciare i singoli neuroni¹^,²^,³. Tuttavia, le stesse proprietà meccaniche che riducono i danni alla tosatura⁴ e conferiscono biocompatibilità e capacità di registrazione²^,³^,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸ pongono una sfida per il loro inserimento nel cervello rispetto alle loro controparti rigide. Il lavoro precedente ha portato a termine un massimo di quattro array a 32 canali, ma il rendimento totale dei singoli neuroni putativi ordinati non è segnalato²^,³^,⁹. Al contrario, gli array di elettrodi a base di silicio sono stati utilizzati in impianti multiregione ad alta densità, ma queste tecnologie non hanno la capacità di registrare i picchi dei neuroni nel corso dei mesi (longevità) o di monitorare gli stessi neuroni (stabilità) su quella scala cronologica, o la densità di registrare da centinaia di singoli neuroni in più regioni del cervello. Il metodo qui presentato supera il basso numero di inserimenti negli attuali metodi basati sugli array di elettrodi polimerici, fornendo così mezzi per la registrazione elettrofisiologica di un gran numero di singoli neuroni in più regioni anatomiche distanti per mesi, con la stabilità di registrare dagli stessi singoli neuroni in molti giorni.

C’è qualche dibattito per quanto riguarda l’importanza di utilizzare un substrato polimerico invece di strategie basate su microfili o silicio. Come dimostrato da Dhawale et al.¹⁰, i microfili sono infatti in grado di registrare stabili lunghi mesi nei roditori, anche se gli impianti erano limitati a 16 tetrodi in un’unica regione. L’aumento delle dimensioni dell’impianto a microfilo raggiunge un limite superiore relativamente elevato, con fino a 1792 canali impiantati raggiunti in un primate non umano^11. Tuttavia, la costruzione degli array di microfili è incompatibile con i processi di nanofabbricazione del silicio e richiede quindi molto tempo, richiede la gestione manuale di ogni canale singolarmente durante la costruzione¹²^,¹³ ^,¹⁴. Come tale, non è chiaro se questa tecnologia potrebbe supportare un aumento dell’ordine di grandezza nei canali di registrazione.

Gli attuali dispositivi in silicio possono posizionare centinaia o addirittura oltre mille elettrodi su un unico dispositivo monolitico¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Gli ultimi processi di fabbricazione del silicio generano dispositivi con aree trasversali più piccole, indipendentemente dal materiale, con conseguente attivazione meno gliale²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴ e più dispositivi conformi. C’è una variabilità nelle relazioni di sonda di silicio single-unit registrazione di longevità, alcuni indicano che relativamente grandi sonde di silicio in grado di fornire la registrazione a lungo termine²⁵^,²⁶. In particolare, gli ultimi dispositivi in silicio disponibili in commercio¹⁷ hanno la longevità di registrare per diversi mesi e hanno aree trasversali molto simili ai gambi utilizzati nel metodo qui descritto (Jun et al. 2017¹⁷: 70m x 20 m, dispositivi descritti qui e in Chung et al. 2019¹: 68 m – 80 m x 14 m). A causa della differenza di stabilità, questa sonda non è stato dimostrato di essere in grado di registrare dagli stessi neuroni nel corso delle settimane. Questo probabilmente è dovuto ad una combinazione dell’uso di silicio rigido così come il tethering diretto al cranio, noto per causare micromozione, instabilità, e gliosi all’interfaccia array-cervello²⁷^,²⁸. Per costruire un dispositivo in grado di muoversi con il tessuto neurale, sono necessari materiali che sono^morbidi⁵,²⁹ e^{flessibili 7.} Molti polimeri disponibili (cfr. Geddes e Roeder³⁰, Fattahi et al.³¹e Weltman et al.³² per le recensioni) hanno la flessibilità e la stabilità dei microfili e sono compatibili anche con i processi di nanofabbricazione, che consentono di l’imballaggio denso di dispositivi in silicio.

Diversi problemi di impianto neurale sono specifici per l’uso di array di elettrodi polimerici flessibili. Il primo di questi è l’inserimento dell’array, poiché gli array flessibili non hanno la rigidità di essere avanzati nel cervello come strategie basate su silicio o microfili. La maggior parte delle strategie di inserimento per i dispositivi flessibili dipende da un irrigidimento temporaneo del substrato come avviene in questo metodo (vedere Weltman et al.³² per la revisione). Ci sono cinque strategie degne di nota che non fanno uso di una navetta rigida. In primo luogo, ci sono metodi che fanno uso di materiali che passano da rigido a conforme su impianto³³^,³⁴. Uno svantaggio di questa strategia è che richiede un’area trasversale relativamente grande per ottenere la forza necessaria per la penetrazione del tessuto cerebrale prima della deformazione come dettato dal calcolo della forza di deformazione di Eulero³⁵. Questo aumento dell’area trasversale avrà un impatto negativo sulla salute del tessuto circostante²⁰^,²¹^,²²^,23^,²⁴. Il secondo è l’uso di una struttura di supporto rimovibile sopra il cervello³⁶, anche se questo richiede la rimozione o la dissoluzione di impalcature per mantenere una lunghezza minima non supportata (e un’elevata forza di deformazione). In alternativa, sarebbe necessario inserire l’array con una lunghezza non supportata più lunga, richiedendo in tal modo un substrato di array più rigido o un’area di sezione trasversale dell’array più grande. Terzo è pre-penetrazione per aprire un foro per l’array flessibile da inserire in seguito³⁵. Ciò richiede un riallineamento preciso o un diametro pre-penetrazione relativamente grande e la rigidità dell’array di elettrodi e l’area della sezione trasversale per consentire l’inserimento non supportato. Quarto è l’uso di rivestimenti dissolvibili per irrigidire il dispositivo flessibile. Questo aumenta significativamente l’area della sezione trasversale e i danni acuti causati dall’inserimento, anche quando vengono prese precauzioni speciali per preservare la punta affilata di un dispositivo³⁷. Quinto è l’iniezione dell’array polimerico. Questa strategia ha avuto successo nel raggiungimento di impianti con un massimo di quattro inserimenti 32 ch², ma richiede l’utilizzo di un’area trasversale molto più grande per l’inserimento, un 250 – 1,5 mm di diametro esterno tubo capillare di vetro⁹, causando maggiori danni acuti. Al contrario, l’utilizzo di una navetta rimovibile, aggiungendo l’area trasversale all’inserimento acuto, consente l’uso dei materiali più rigidi possibili e può, quindi, essere la dimensione minima teorica quando si inserisce un dispositivo arbitrariamente flessibile. Così, l’inserimento utilizzando una navetta rigida è attualmente l’opzione più attraente per l’inserimento di dispositivi flessibili.

Ci sono due requisiti di qualsiasi approccio navetta di inserimento: un substrato opportunamente rigido e un modo per accoppiare il dispositivo flessibile al substrato. I materiali navetta di inserimento sono in genere^{silicio 38}^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹, acciaio inossidabile⁸^,⁴²o tungsteno⁴³^,⁴⁴^, ⁴⁵, con materiali più rigidi che consentono aree trasversali più piccole. Questi sono tipicamente apposti utilizzando un adesivo come il polietilene glicole (PEG)⁸^,³⁸^,³⁹^,⁴²^,⁴³, forze elettrostatiche⁴⁰, o diretto accoppiamento fisico⁴⁵^,⁴⁶. In tutti i casi, le sfide sono l’allineamento e l’accoppiamento dell’array di elettrodi e dello shuttle di inserimento prima dell’inserimento e del disaccoppiamento dopo l’inserimento. Di seguito è riportato il metodo introdotto da Felix et al.³⁹ per rinforzare temporaneamente l’array di elettrodi con una navetta di inserimento in silicio, collegata utilizzando PEG, che viene rimossa dopo l’inserimento dell’array alla sua profondità di destinazione.

Una seconda sfida presentata dai dispositivi flessibili all’interno di un impianto cronico è quella di stabilizzare il dispositivo all’interno del cervello, pur consentendo al tempo stesso l’integrated del dispositivo in un impianto collegato al cranio. Il cervello si muove rispetto al cranio a causa di pulsazioni naturali, cambiamenti edematosi post-traumatici, impatto e altre cause, e l’array di elettrodi deve quindi essere almeno un po ‘libero di muoversi rispetto a dove è apposto al cranio e hardware di registrazione. Ciò si ottiene utilizzando un pezzo di base in plastica stampato in 3D, progettato su misura per ogni serie di obiettivi implantari, che ha molteplici funzioni: un serbatoio saline durante l’impianto, la posizione per letare gli array polimerici e l’alloggiamento per gel di silicone. La posizione di tetratura sopra il cranio e gel di silicone lavorano insieme per creare un raggio di curvatura maggiore per l’array e quindi consentire forze di compressione più grandi sulla matrice. Questo a sua volta permette che il movimento del cervello rispetto ai punti di ancoraggio della serie (teschio) venga tradotto in carico di deformazione.

Ulteriori sfide includono la necessità di ospitare più array e fornire un ampio sollievo sforzo per l’animale a comportarsi liberamente senza il trasferimento di vibrazioni o forze di impatto agli array di elettrodi, che può causare il movimento rispetto al tessuto neurale. Gli adattamenti alle soluzioni che sono state utilizzate in applicazioni simili in cui il cervello deve essere stabile rispetto a una finestra di registrazione rigida hanno affrontato questa sfida. Un gel di silicone in silicone in dural artificiale (Tabella dei materiali), che in precedenza è stato dimostrato essere non tossico e previene la perdita di CSF⁴⁷, fornisce contropressione al cervello per prevenire il gonfiore verso l’esterno e stabilizzare l’array a la superficie del cervello. Un ulteriore strato di protezione viene aggiunto ai nastri del dispositivo dalla media viscosità, elastomer in silicone di grado chirurgico, precedentemente dimostrato per l’uso in impianti di elettrodi neurali cronici di sigillazione⁴⁸. Infine, l’impianto tampone in silicone e la copertina sono racchiusi in pezzi stampati in 3D su misura per mantenere un basso centro di massa per una riduzione minima della normale mobilità dell’animale.

Questo protocollo inizia con un microelettrodo a microelettrodo polimerico flessibile montato su una navetta per l’inserimento in silicio. Procede con il montaggio del dispositivo array-shuttle ai pezzi di inserimento stampati in 3D, descrive la tecnica chirurgica e i passaggi di costruzione dell’impianto necessari per impiantare con successo un animale ed è in grado di supportare sedici polimeri multi-elettrodi array impiantati in otto regioni anatomicamente lontane in un singolo ratto¹.

Questo protocollo assume i materiali di partenza degli array di elettrodi polimerici collegati dal biodissolvable adesivo polyethylene glycol (PEG) a una navetta per l’inserimento in silicio, come mostrato in Felix et al.^39,e almeno due inserimenti mobili in modo indipendente pezzi: uno a cui sarà incollata la navetta in silicio e uno a cui sarà aderito il connettore dell’array di elettrodi. Questo protocollo utilizza anche un terzo pezzo di inserimento per collegare in modo più sicuro i due pezzi di inserimento a un micromanipolatore in scala micron. Tutti i file per la stampa 3D sono disponibili all’https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

Ogni array di elettrodi polimerici, utilizzato in questo metodo è costituito da due o quattro gambi di registrazione, un nastro che trasmette le tracce elettriche e, alla fine del nastro, un connettore hardware o un circuito stampato. La matrice di elettrodi e il nastro sono fissati in cima alla navetta in silicio con PEG. Ogni nastro ha un tubo di poliimide di 2 cm di spessore x 1 mm collegato al nastro tramite resina epossidica curabile UV, che si estende perpendicolare alla lunghezza del nastro. Ogni dispositivo (matrice di elettrodi e shuttle di inserimento) deve essere caricato sui pezzi di inserimento stampati in 3D che verranno utilizzati per inserire l’array nel cervello e ritirare lo shuttle (Figura 1). In questo progetto, il micromanipolatore di inserimento idraulico (verde, tavolo dei materiali) sposta l’intero apparato di inserimento (pezzo 1, pezzo 2 e il micromanipolatore di retrazione, arancione) alla sua profondità di destinazione. Una volta che l’array è stato staccato dall’apparato di inserimento e fissato, il secondo micromanipolatore di retrazione (arancione) ritrae il pezzo 1 e la navetta collegata indipendentemente dal resto dell’apparato di inserimento, rimuovendo la navetta senza spostare l’array.

Figura 1: componenti dell’inserto.
(A) I pezzi 1 e 2 sono temporaneamente fissati l’uno all’altro con una vite rimovibile e saranno successivamente agganciati al pistonere micromanipolatore di retrazione (arancione). (B) L’array e lo shuttle di inserimento sono aderiti al pezzo 1 e il connettore dell’array è collegato al pezzo 2 con nastro a doppia lato. Il pezzo 3 collega il micromanipolatore di retrazione e i pezzi 1 e 2 al micromanipolatore di inserimento (verde). Il micromanipolatore di inserimento è fissato a un adattatore stereotassico per il posizionamento dell’impianto. I pezzi 1-3 sono raffigurati nelle loro dimensioni relative. Il pezzo 4 è un pezzo stabilizzante per un corretto allineamento della navetta di inserimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutti i protocolli coinvolti in animali descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’UCSF. 1. Preparazione di array di elettrodi polimerici per l’inserimento (30 min) Fissare il pezzo 1 al pezzo 2 inserendo una vite attraverso fori allineati e orientati verticalmente per bloccare i pezzi insieme (Figura 2). Tieni questi due pezzi in un vizio. Attaccare il nastro fronte/retro (Table of Materials) alla parte superiore del pezzo 2. Fissare il pezzo stabilizzante 4 all’estremità del pezzo 1. Sarà tenuto in posizione da attrito. Figura 2: Assembly per l’allineamento array-shuttle.(A) Assemblaggio di pezzi 1, 2 e pezzo stabilizzante in preparazione dell’attacco navetta di inserimento. (B) Pezzi 1 e 2 tenuti insieme con vite del pollice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. A mano, allineare l’array di elettrodi e attaccare lo shuttle di inserimento con il segmento finale stretto del pezzo 1. Quando la sonda è allineata con l’asse longitudinale del pezzo 1, aderire al connettore dell’array al nastro a due lati in poliimide sulla porzione piatta del pezzo 2. Con le pinze a punta in plastica, contattando solo l’ala di poliimide attaccata al nastro dell’array, sollevare la punta del dispositivo di inserimento shuttle-elettrodo dal pezzo 1, all’esterno del pezzo stabilizzante (Figura 3A). Applicare una piccola quantità di cianoacrilato (Table of Materials) o di altro adesivo (10 dollari l) fino alla fine del pezzo 1. Troppo poco non aderisce fortemente lo shuttle di inserimento al pezzo 1, rischiando il distacco durante l’inserimento o la retrazione. Troppi rischi di traboccare la navetta e aderendo l’array stesso al pezzo 1. Utilizzando pinze a punta in plastica, contattando solo l’ala di poliimide attaccata al nastro dell’array, ri-allineare il dispositivo con il segmento stretto del pezzo 1, con la linguetta quadrata dello shuttle di inserimento (e solo la navetta) in cima alla colla (Figura 3B). Effettuare piccole regolazioni di allineamento manipolando il lato della navetta in silicio o peg. Evitare di applicare una forza eccessiva al nastro o ai ganci. Figura 3: Allineamento, attacco e sterilizzazione della navetta a matrice.(A) Corretto orientamento del dispositivo di inserimento shuttle-elettrodo array per l’applicazione della colla sulla docking station del pezzo 1. Mostrato array-shuttle a due singhiozzo. (B) Matrice di elettrodi polimerici e shuttle di inserimento montata su un pezzo di inserimento, con pezzo stabilizzatore temporaneo per l’allineamento. Mostrato array-shuttle a due singhiozzo. (C) Dispositivo di inserimento racchiuso in una scatola di plastica per la protezione durante la sterilizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Applicare una leggera pressione verso il basso con pinze su entrambi i lati del pezzo stabilizzante e rimuoverlo dall’assieme senza spostare l’array. Rimuovere l’assieme del dispositivo montato (pezzi 1 e 2, array, insertion shuttle e connettore array) dalla morsa e aderirlo con nastro a due lati alla base di una piccola scatola di plastica per la sterilizzazione mediante ossido di etilene (Figura 3C). La sterilizzazione del vapore non è appropriata per questi dispositivi. 2. Progettazione del pezzo di base Determinare le dimensioni della craniectomia per bersagli stereotattici selezionati, nonché le posizioni delle viti del cranio e delle viti a terra. La dimensione della craniectomia è determinata dall’impronta dell’array, con una circonferenza micron di alcune centinaia di (300) per le regolazioni di posizionamento per evitare la vascolatura della superficie. Utilizzando un software di progettazione (ad esempio CAD), progettare l’impronta del pezzo di base per circondare le craniectomie pianificate e adattarsi all’interno del perimetro definito dalle viti temporale e del cranio, massimizzando la superficie del cranio che sarà al di fuori del pezzo di base a cui cemento adesivo luting può legare per aderire l’impianto al cranio. Contornare la superficie inferiore del pezzo di base in modo che possa essere aderente al cranio senza lacune, riducendo la possibilità di infezione e impedendo al senno osomero salina o in silicone di fuoriuscire. Impostare l’altezza del pezzo di base su 3-7 mm, abbastanza alta da contenere il saline e il silicone elastomero, ma abbastanza basso da non ostacolare la visibilità durante l’inserimento dell’array.NOTA: Il pezzo di base può essere progettato con pali verticali o caratteristiche simili a cui le ali di poliimide possono essere letiviate in un punto più in alto sopra il cranio. Non consentire ai punti di attacco di impedire la visualizzazione. Stampa 3D il pezzo di base (Figura 4) e sterilizza il pezzo di base prima dell’impianto. Figura 4: Teschio preparato per l’impianto.Durectomie complete di viti cranica, strato acrilico di base e pezzo base fissato al cranio. 3. Preparazione del cranio (2 h) Selezionare un ratto 400 g o superiore per sostenere il peso dell’impianto. Sono stati usati topi maschi Long-Evans, a 6-12 mesi di età. Anpitizzare il ratto. Posizionare l’animale in una camera di anestesia. Accendere il 5% dell’isoflurane. Iniettare una dose intraperitinale di ketamina (50 mg/kg), xilazina (6 mg/kg) e atropina (0,14 mg/kg). Monitorare la profondità di anestesia ogni 20 min durante la procedura verificando che non vi sia alcun ritiro dal pizzico della zampa e la frequenza respiratoria rimane 50-75 respiri /min. Applicare unguento per gli occhi al topo. Rasa la testa del topo. Posizionare l’animale nel supporto stereotaxic. Preparare il sito chirurgico strofinando con tre scrub alternati ciascuno di scrub chirurgici Povidone-iodio, seguiti da salina sterile. Iniettare 0,2 cc di 0,5% di lidocaina nel cuoio capelluto. Fare un’incisione sagittale alla linea media del cranio esponendo almeno 3 mm anteriore al bregma e 3 mm posteriore alla lambda. Rimuovere il periosteo con tamponi di cotone. Contrassegnare i siti di inserimento e craniectomia segnando il cranio con un bisturi utilizzando un piano di coordinate cartesiane azzerato al bregma con uno strumento stereotassico. Forare siti craniectomia, lasciando un sottile strato di osso che può essere rimosso con pinze. Non esporre dura. Ciò consente di pulire il cranio della polvere ossea senza interrompere la durata. Forare e inserire viti ossee, una alla volta, per evitare che la polvere ossea entri nei fori. Utilizzare una generosa irrigazione isotonica per rimuovere la polvere ossea. Per un impianto di circa 50 grammi, utilizzare 10-12 viti. Le viti in titanio permettono l’osseointegrazione49. Far avanzare le viti ad una profondità che penetra completamente nel cranio senza influenzare il cervello. Collegare almeno una vite ossea a un filo elettricamente conduttivo per funzionare come un terreno di circuito. Dopo che tutte le perforazioni sono complete, pulire il cranio di polvere ossea con un lavaggio salina. Asciugare il cranio con tamponi di cotone o altri assorbenti e applicare uno strato iniziale di cemento adesivo (Tabella dei materiali) alle viti (non utilizzare l’incisione in smalto sul cranio del roditore). Questo strato preliminare di cemento adesivo luting aumenterà l’adesione dell’impianto e diminuirà il lavoro nei passi successivi di adesione. Rimuovere il sottile strato di osso rimanente in ogni sito di craniectomia. Incise dura utilizzando un ago calibro 30 con una punta piegata evitando qualsiasi vascolatura. La lunghezza dell’incisione corrisponde alle dimensioni dello shuttle di inserimento. Se c’è sanguinamento, irrigare manualmente con una leggera flebo salina e non continuare fino a quando l’emorragia si è fermata. Se vengono eseguite più durectomie, mantenere i siti umidi con schiuma di gel o un altro metodo, come l’irrigazione regolare ogni pochi minuti con la temperatura corporea salina. Asciugare nuovamente il cranio con tamponi di cotone o altri assorbenti in preparazione per l’adesione al cemento del pezzo di base al cranio. Posizionare il pezzo di base sterile. Se il pezzo di base coprirà il bregma, segnare un’altra posizione a una distanza nota come proxy. Applicare il cemento adesivo di luting intorno al perimetro del pezzo di base. Riempire il pezzo di base aderito con salina; identificare e correggere eventuali perdite con cemento di luting adesivo all’interfaccia tra il pezzo di base e l’interfaccia del cranio (Figura 5).NOTA: È fondamentale che il pezzo di base sia completamente fissato al cranio per evitare perdite del gel di silicone sigillante durale artificiale, in quanto ciò impedirà un’adeguata adesione dell’impianto al cranio. L’animale è pronto per avere array inseriti. 4. Inserimenti seriali di matrici e ritrazioni di navette (1 h per array) NOTA: questa procedura deve essere pilotata con un dispositivo non vitale, in particolare per gli impianti a più array in cui un dispositivo può interferire con l’impianto di dispositivi successivi. Caricare i pezzi 1 e 2 sul pistone del micromanipolatore di retrazione. Impostare il micromanipolatore del pezzo 1 su una posizione estesa e il micromanipolatore del pezzo 3 in una posizione retratta. Il pistone scorrerà ad una profondità terminale all’interno del pezzo 1. Il pezzo 2 si inserisce all’interno della parte superiore del pezzo 3, con i fori allineati. Caricare il pezzo 3 sul pistone micromanipolatore di inserimento e fissarlo in posizione con una vite sulla parte inferiore del pezzo 3 (Figura 5A,B). Caricare e avvitare i pezzi 2 e 3 insieme, in modo che lo spostamento del micromanipolatore di inserimento sposti l’intero apparato di inserimento (Figura 5C). Rimuovere la vite che tiene i pezzi 1 e 2 insieme. Il pezzo 1 si muove indipendentemente dal pezzo 2, per consentire la retrazione separata della navetta di inserimento dall’apparato. Inserire questa vite nel foro laterale del pezzo 1, perpendicolare alla pista del pistone, fino a quando la vite applica pressione sul pistone. Questo assicura che il pezzo 1 si muove in conformità con il pistone retrattile, come si vede nella Figura 5D. Assicurarsi di scegliere il foro laterale che non ostacolare la visione quando l’apparecchio è montato sullo strumento stereotassico. Figura 5: Assemblaggio dell’insertore.(A) Montaggio del pezzo 3 ai micromanipolatori. (B) Attacco di pezzi 1 e 2 sull’apparato di inserimento. (C) Pezzi di inserimento con dispositivo shuttle ad inserimento dell’array di elettrodi montato. (D) Vite del pollice che tengono i pezzi 1 e 2 insieme rimossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Rimuovere eventuali gel-foam dalle craniectomie. Usa il bregma reale o proxy per il targeting stereotassico. Quando si sposta il dispositivo sul sito di inserimento, mantenere un’altezza di almeno pochi centimetri sopra il cranio. Evitare periodi prolungati del dispositivo array-shuttle vicino al cranio o al cervello per diminuire le probabilità che la condensa stacchi l’array dalla navetta di inserimento prima o durante l’inserimento. In questo caso, tentare di sollevare il dispositivo array-shuttle sopra il cervello e il cranio e attendere che si asciughi e riaderisci. Regolare le coordinate dell’impianto per evitare la vascolatura superficiale. Come durante la craniectomia e la durectomia, evitare di penetrare direttamente i vasi. Inserire il dispositivo in modo vivace (25 m/s), abbassandolo con lo strumento stereotassico fino a quando il dispositivo non entra nel cervello. Il dispositivo non penetra immediatamente nel cervello. Il grado di resistenza e di fossetta dipenderà dalla posizione di destinazione e dal design del dispositivo (ad esempio, due se non quattro montanti, angolo della punta), ma la fossetta di solito non supera 1 mm (Figura 6). Figura 6 : Inserimento Array-shuttle.Array-shuttle è avanzato nel cervello per la profondità bersaglio. Mostrato a quattro singhiozzo array-shuttle. Una volta nel cervello, più in basso con micromanipolatore, diminuendo la velocità in avvicinamento alla profondità del bersaglio: Utilizzare il braccio stereotassico per iniziare l’inserimento a 25 m/s. Utilizzare il micromanipolatore per inserire a 10 m/s quando 2 mm a 1 mm sopra la profondità di destinazione. Inserimento lento con micromanipolatore a 5 m/s quando da 1 mm a 500 m sopra la profondità di destinazione. L’inserimento lento ulteriormente a 1-2 m/s durante gli ultimi 500 m al bersaglio. Visualizzare le ali del dispositivo (tubo di poliimide orizzontale) e il punto di inserimento durante l’abbassamento per evitare il prematuro distacco shuttle-array. Una volta raggiunta la profondità di destinazione (Figura 7A), ancorare bilateralmente le ali di poliimide ai siti di fissaggio del pezzo di base tramite acrilico luce-curable o un altro adesivo come il cianoacrilato (Tabella dei materiali). Asciugare, se necessario, le ali o il punto di attacco sul pezzo di base, come condensa può raccogliere su queste superfici e prevenire l’adesione. Se la visibilità o altri vincoli di spazio lo richiedono, l’ancoraggio a una sola ala poliimide è in genere sufficiente. Prima della dissoluzione, il PEG apparirà come una massa globulare seduta sopra l’array e l’interfaccia shuttle di inserimento (Figura 7A). Sciogliere PEG gocciolando delicatamente la temperatura corporea sulla matrice nel punto in cui è aderente alla navetta. Il periodo di tempo necessario dipenderà dal peso molecolare del PEG selezionato e la completa dissoluzione può essere verificata con la visualizzazione diretta. Quando il PEG ha completamente sciolto i confini degli array sarà completamente distinguibile dallo shuttle e pezzo 1 (Figura 7B). Figura 7: Ritrazione della navetta.(A) Tethering di ali prima della ritrattazione. Matrice a due sinisti e navetta mostrata. (B) Dissoluzione PEG e adesione alare con funzione di gambo (cerchiato, blu) che consente la conferma visiva del disaccoppiamento riuscito dell’array e dello shuttle durante la ritrazione. (C) Un inserimento di matrice riuscito dopo l’inserimento navetta è stato ritirato. (D) Pezzo di base con gel di silicone si riempie per un singolo inserimento di matrice a due singhi. Il gel in silicone a bassa viscosità utilizzato ha una tinta blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Utilizzando il micromanipolatore di retrazione, ritirare lentamente la navetta di inserimento. Continuare l’irrigazione salina (1 goccia/s) sull’array in fase di ritiro. Utilizzare velocità di retrazione uguali alla velocità di inserimento a distanze rilevanti dalla profondità di destinazione: Ritrarre il micromanipolatore a 1-2 m/s dalla profondità bersaglio a -500 m. Accelerare la retrazione utilizzando il micromanipolatore a 5 m/s quando da -500 m a -1 mm. Accelerare la retrazione utilizzando il micromanipolatore a 10 m/s quando -1 mm a -2 mm. Ritrarre utilizzando il braccio stereotassico a 25 m/s da -2 mm dal bersaglio e verso l’alto. Visualizzare l’interfaccia tra la matrice e lo shuttle di inserimento durante la ritrazione. L’array polimerico visibilmente separato dalla navetta e appare traslucido come la navetta viene ritratta alla giunzione semicircolare tra i gambi della navetta di inserimento (Figura 7B). Rimuovere il connettore dell’array dal pezzo 2 e spostarsi in una posizione che non interferisca con gli inserimenti successivi. L’array di elettrodi polimerici è ora nel cervello e non è più collegato allo strumento stereotassico (Figura 7C). Rimuovere lo shuttle di inserimento e altro hardware di inserimento. Per più inserimenti, ripetere i passaggi da 4.1 a 4.9; non passare alla sezione successiva fino a quando non vengono inserite tutte le matrici desiderate. Si consiglia di inserire due dispositivi entro 250 m l’uno dall’altro, poiché il leggero inchino del nastro del dispositivo tra il cervello e le ali nella regione di rilievo di deformazione può estendersi almeno fino a questo punto. 5. Costruzione dell’impianto (2 h) Dopo l’inserimento finale della matrice, salina vuota dal pezzo di base utilizzando una pipetta o un tampone di cotone, facendo attenzione a non interrompere gli array o nastri impiantati. Riempire le craniectomie e il pezzo di base con elastomer in silicone a bassa viscosità, o altro sigillante durale artificiale. Consentite la cura (Figura 7D). Con più inserimenti, posizionare i connettori hardware nel punto in cui non interferiscono (Figura 8A). Orientare opportunamente i connettori della matrice e costruire l’impianto, in modo che i nastri siano nella posizione finale desiderata. Coprire gli array, i nastri di array e i connettori in elastomer in silicone a media viscosità. Prestare particolare attenzione all’interfaccia polimerico-connettore, in quanto questa interfaccia materiale soft-hard è soggetta a danni. Coprire completamente i nastri dell’array in modo che quando il silicone a media viscosità guarisca, siano immobilizzati. Racchiudere i dispositivi coperti da elastomer nella custodia progettata. Rafforzare la base dell’impianto con acrilico dentale. Non permettere che l’acrilico entri in contatto diretto con i nastri della matrice perché l’espansione dell’acrilico durante le cure può danneggiare le tracce conduttive. Applicare l’unguento Bupivicaine e bacitracin intorno all’incisione. Chiudere l’incisione con suture di nylon 4-0 e colla per la pelle. 6. Recupero e cura dell’impianto Rimuovere l’animale dallo strumento stereotassico e posizionare su un lato su un pad di riscaldamento. Dare l’iniezione sottocutanea della soluzione calda Ringer (5 –10 mL) per idratare l’animale. Una volta che l’animale è locomoting (10 –60 min), trasferire in una gabbia con metà della gabbia sotto una piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi per 2-3 giorni. Sotto una piastra di riscaldamento, dare accesso al cibo ammorbidito e acqua. Iniettare animale con 2 mg/kg di Meloxicam ogni 24 h (somministrazione sottocutanea o orale) per 1 settimana, se necessario per il controllo del dolore. Lasciare che il ratto 1-2 settimane guarisca e si adatti al peso dell’impianto (Figura 8B). Eseguire il lavaggio regolare clorboscodino del tessuto intorno all’impianto e l’ispezione quotidiana per irritazione, infezione o dehiscenza. Figura 8: Più array inseriti e ratto dopo il recupero dall’impianto. (A) Connettori hardware in posizioni che non interferiscono con gli inserimenti successivi. (B) Un impianto a 1.024 canali, matrice polimerica cronica. Riprodotto con il permesso di Neuron [Figura supplementare 1H]1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Seguendo questo protocollo, una registrazione di impianto neurale a 1.024 canali ha prodotto 375 singole unità1 (ordinate con MountainSort50, sovrapposizione del rumore 0,96, 512 canali utilizzati per la registrazione di unità singola, Figura 9A). Questo protocollo può essere utilizzato per impiantare diversi numeri di dispositivi, con diversi conteggi di canali e specifiche, a diverse combinazioni di obiettivi di registrazione. Utilizzando lo stesso protocollo, la longevità di registrazione di una singola unità è stata dimostrata per almeno 160 giorni1 in dati provenienti da 19 dispositivi (18 dispositivi a 32 canali in cortice prefrontali, un dispositivo a 64 canali nella corteccia orbitofrontale) su tre ratti diversi ( Figura 9B). Uno dei tre animali ha avuto un guasto elettrico digitale con conseguente incapacità di registrare da quattro dispositivi. Dei restanti 15/19 dispositivi, c’era una media di registrazione di 1 singola unità per canale. I singoli dispositivi avevano rendimenti solo di poche unità singole fino a 2 unità per canale. È tipico vedere rese molto diverse su dispositivi impiantati nello stesso animale nella stessa regione. Inoltre, un’altra squadra chirurgica che ha seguito il protocollo qui descritto ha impiantato altri sei animali, ciascuno con una combinazione di 4-6 dispositivi a 32 canali mirati alla corteccia orbitofrontale e al nucleo accumbens, e un iperguida tetrode (impianto totale peso di circa 50 g). Un animale ha avuto un distacco dell’impianto entro un mese dall’intervento chirurgico. Un secondo animale è morto durante il periodo di recupero post-operatorio, probabilmente non correlato alle fasi del protocollo qui descritte. I restanti quattro animali sono rimasti sani con impianti stabili che per la durata dell’esperimento, che è durato 4-11 mesi. I conteggi di unità singole erano simili a quelli precedentemente riportati per i dispositivi a 32 canali. Figura 9: Produzione di unità singole e longevità di registrazione.(A) Numero di cluster putativi a unità singola provenienti da 512 canali (dell’impianto a 1.024 canali), stratificati da soglie metriche di qualità. La cura automatica utilizzando MountainSort (rumore sovrapposto 0.03, isolamento 0.96, scatola nera in alto a destra) ha portato all’identificazione di 375 unità singole dai 512 canali. Riprodotto con il permesso di Neuron [Figura 2A]1. (B) Rendimenti a unità singola per matrici di polimeri per canale (asse y sinistro) o per gambo a 16 canali (asse y destro) per 160 giorni dopo l’impianto (asse x) nei ratti. La linea continua è il rendimento medio delle celle su 8 gambi, linee tratteggiate – 1 SE. I singoli punti temporali per gambo sono indicati come punti codificati a colori per regione. Riprodotto con il permesso di Neuron [Figura 3A]1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo è un metodo per l’impianto di più array di elettrodi polimerici in aree cerebrali distribuite per la registrazione di singole unità su mesi. Questo metodo rappresenta un aumento di 8 volte nei canali di registrazione e un aumento di 4 volte del numero di inserimenti dal sistema basato su polimeri su larga scala più vicino²^,³. Tale sistema utilizzava un sistema basato sull’iniezione di mesh polimeriche nel mouse, ma non riportava un numero assoluto di unità singole putative e quindi non è possibile un confronto della resa dei singoli neuroni.

Il metodo per l’inserimento di un dispositivo flessibile si basa su un protocollo precedente di Felix et al.³⁹, con importanti modifiche: un apparato di inserimento a tre pezzi per il movimento indipendente della navetta in silicio durante la ritrazione e il tethering dell’array alla sua profondità di destinazione prima della ritrazione della navetta, che insieme eliminano la necessità di un rapido ritiro descritto nel protocollo originale. Queste modifiche riducono al minimo i danni ai tessuti e mantengono la stabilità dell’array durante la retrazione della navetta. Altre strategie flessibili di impianto dei dispositivi, come i dispositivi di irrigidimento temporanea con materiali bio dissolvable, sono compatibili con i passaggi successivi di questo protocollo. La messa in sicurezza dei dispositivi all’interno dell’impianto ha richiesto l’integrazione di strategie precedentemente convalidate per coprire il cervello e proteggere i delicati nastri dei dispositivi.

A causa della loro fragilità, la cura e l’attenzione sono necessarie per evitare di contattare direttamente o altrimenti la forza di trasmissione agli array di elettrodi polimerici e alle navette per l’inserimento in silicio. In particolare quando si lavora con più dispositivi, l’inserimento deve essere osservato al microscopio per evitare interferenze di un dispositivo con un altro. In generale, è possibile gestire delicatamente un array di elettrodi con pinze rovesciate in plastica, evitando le tracce. Tale strategia è appropriata, ad esempio, se l’array di elettrodi polimerici inizia a ritrarsi con lo shuttle di inserimento. Ciò può verificarsi se il PEG non è completamente disciolto, o a causa della tensione superficiale di salina o CSF tra il polimero e il silicio.

Uno degli errori recuperabili più comuni è il distacco degli array dallo shuttle di inserimento. Ciò può verificarsi all’inserimento, come il cervello fossette e pressione alla punta del dispositivo aumenta, se l’array e shuttle sono perfettamente allineati o se la condensa ha parzialmente sciolto il PEG. Per aderire nuovamente un array, sollevarlo il più in alto possibile sopra la superficie del cervello e attendere che si asciughi (circa 5 min).

Un aspetto critico della pianificazione di un intervento di impianto multi-array è la progettazione del pezzo di base per ospitare tutti gli obiettivi dell’impianto e sedersi senza spazi contro il contorno del cranio. Il pezzo di base è un piccolo pezzo di plastica che viene fissato al cranio dopo la pulizia del cranio, il posizionamento della vite e craniectomie parziali, prima dell’inserimento degli array. Ha tre funzioni: 1) tenere salina per sciogliere il PEG dopo l’inserimento dell’array ma prima della retrazione dello silicio shuttle, 2) per fornire una posizione sopra la superficie del cranio a cui gli array possono essere attaccati da ali di poliimide, consentendo così il sollievo della deformazione lungo il nastro sopra il suo punto di inserimento nel cervello, e 3) per contenere sigillante durale artificiale, che stabilizza e protegge gli array e il cervello. Il pezzo base può essere modellato a mano o stampato in 3D. È stato osservato che il drenaggio e l’essiccazione del pezzo di base della salina sono molto importanti per l’inserimento del dispositivo precedente. Questi passaggi impediscono la condensazione e la separazione dell’array e dello shuttle di inserimento. L’essiccazione del pezzo di base è anche fondamentale per riempire il pezzo di base con sigillante durale artificiale. È anche importante che il pezzo di base non perda, come una pellicola di gel di silicone è difficile da rimuovere dal cranio e impedirà l’adesione dell’acrilico dentale per un affidabile attaccamento cronico dell’impianto al cranio. Si prevede che qualsiasi elastomero in silicone biocompatibile a bassa viscosità potrebbe essere usato per riempire le craniectomie e il pezzo di base, con un elastomer in silicone a viscosità più alta che lo circonda e i nastri a vista della matrice di polimeri.

I progressi nella nanofabbricazione polimerica si tradurranno in array di elettrodi basati su polimeri, riducendo le dimensioni delle caratteristiche e aumentando il possibile numero di elettrodi in un array più vicino a quello dei dispositivi di silicio¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ ^,¹⁸^,¹⁹. Allo stesso modo, le aree trasversali dei dispositivi polimerici si ridurranno insieme alle dimensioni delle funzioni, fornendo una compatibilità ancora migliore⁸. Anche in questo caso, come si sta realizzando con i dispositivi in silicio, l’integrazione con amplificazione, digitalizzazione e chip multiplexing¹⁷ consentirà ulteriormente la registrazione neurale su larga scala.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NINDS U01NS090537 a L.M.F e V.M.T., dalla concessione NIMH F30MH109292 a J.E.C, e la sovvenzione NIMH F30MH115582 a H.R.J. J.E.C. e H.R.J. sono supportate da #T32GM007618. Il Flatiron Institute è una divisione della Fondazione Simons.

Materials

3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1)	N/A	N/A	3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
	N/A	N/A	https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set)	Colten/Whaledent	8886784, 8881627	Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2)	Narishige Group	MO-10	1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape	Bertech	PPTDE-1/2	Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm	Kopf Instruments	103088R, 103088L	Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow	Coltene/Whaledent	D33-01-00	Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control	Henkel Corp.	234790 1364076 1735574 1752699	Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement	Parkell	S380	For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles	Lawrence-Livermore National Laboratory	N/A	Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity	Dow Corning	03/80	Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit	World Precision Instruments	Kwik-Sil	Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays

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Chung, J. E., Joo, H. R., Smyth, C. N., Fan, J. L., Geaghan-Breiner, C., Liang, H., Liu, D. F., Roumis, D., Chen, S., Lee, K. Y., Pebbles, J. A., Tooker, A. C., Tolosa, V. M., Frank, L. M. Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays. J. Vis. Exp. (152), e59957, doi:10.3791/59957 (2019).